莊林波，王立勝，余非，韓士英

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳寶安區(qū)中心醫(yī)院骨科，廣東深圳518102;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東廣州510000)

實(shí)驗(yàn)研究

茶多酚的抗氧化作用對(duì)大鼠骨折愈合的影響研究

莊林波1，王立勝1，余非1，韓士英2

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳寶安區(qū)中心醫(yī)院骨科，廣東深圳518102;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東廣州510000)

目的探討茶多酚的抗氧化作用對(duì)大鼠骨折愈合的影響。方法將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，每組各20只。A組(模型組):于大鼠右脛骨中段制造橫斷骨折愈合模型;B組(茶多酚干預(yù)組):造模后給予茶多酚(1.0 g/kg)治療;C組(茶多酚防治組):造模前后均給予茶多酚。每組大鼠分別于造模后第7、14天隨機(jī)處死10只，測(cè)量其血液中丙二醛和超氧化物歧化酶的含量，并取右脛骨骨折端骨痂制成切片，測(cè)量其厚度。結(jié)果造模后第7天，B組、C組與A組比較，血液中丙二醛含量降低，超氧化物歧化酶含量升高，骨痂厚度升高，且以C組變化更顯著;造模后第14天，三組血液中丙二醛含量及超氧化物歧化酶含量相近，B組、C組骨痂厚度較A組升高。結(jié)論茶多酚在大鼠骨折愈合早期有一定促進(jìn)作用，其機(jī)制與茶多酚的抗氧化性密切相關(guān)。

茶多酚;抗氧化作用;骨折愈合;氧化應(yīng)激;大鼠

茶多酚是茶葉中的重要組成成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中有多個(gè)活性羥基，因而有較強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)人體健康極為有利。近些年，茶多酚的抗骨質(zhì)疏松作用被學(xué)者們廣泛關(guān)注［1］，其機(jī)制與茶多酚的抗氧化作用密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道茶多酚是通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減少骨丟失，最終發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的［2-3］。據(jù)此，筆者推測(cè)茶多酚在骨折愈合過程中也可能發(fā)揮相似的作用，通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減少骨丟失，加快骨折愈合過程。為驗(yàn)證該推斷，本研究擬建立大鼠右脛骨骨折愈合模型，通過觀察茶多酚干預(yù)后的大鼠骨痂厚度、氧化應(yīng)激指標(biāo)變化情況，來探討茶多酚的抗氧化作用對(duì)骨折愈合的影響。(400±25)g，由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。材料:茶多酚(上海研生生化試劑有限公司，純度98.0%)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(廣州金域生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心)、顯微鏡(深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院)。

1.2方法

1.2.1骨折愈合模型制作以8%水合氯醛按0.4mL/100 g劑量腹腔注射麻醉，將大鼠固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)上，右小腿剃毛、消毒，取小腿前側(cè)切口，顯露脛骨中段，用鋼鋸橫行鋸斷

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性SD大鼠60只，體重脛骨，并造成約3mm的骨質(zhì)缺損，生理鹽水沖洗，止血，然后縫合切口，不做固定。術(shù)后予保暖、預(yù)防感染等護(hù)理措施。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥將60只大鼠隨機(jī)分為3個(gè)組，每組各20只，所有大鼠造模前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)設(shè)定茶多酚的干預(yù)濃度為1.0 g/kg，加入3 mL生理鹽水經(jīng)胃灌入，每天1次。A組(模型組)，造模前7 d和造模后均經(jīng)胃灌注等量對(duì)照液(生理鹽水);B組(茶多酚干預(yù)組)，造模前7 d經(jīng)胃灌注對(duì)照液，造模后經(jīng)胃灌注茶多酚溶液;C組(茶多酚防治組)，造模前7 d和造模后均經(jīng)胃灌注茶多酚溶液。

1.2.3血液檢測(cè)每組大鼠分別于造模后第7、14天隨機(jī)處死10只，每只大鼠開胸經(jīng)心取血，并保存，按說明書步驟檢測(cè)大鼠血液中的MDA和SOD含量。

1.2.4骨痂厚度測(cè)量每組大鼠分別于造模后第7、14天隨機(jī)處死10只，開胸取血后，取右小腿原手術(shù)切口，顯露脛骨骨折處，以骨折端為中心上、下5mm取骨痂。所取骨痂經(jīng)脫鈣、石蠟包埋等程序處理后，制成切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下測(cè)量骨痂厚度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，MDA、SOD和骨痂厚度結(jié)果均采用(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨折愈合不同時(shí)期MDA測(cè)量結(jié)果在造模后第7天，B組MDA含量均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); C組MDA含量低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。造模后第14天，B組、C組MDA含量與A組相近，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳細(xì)資料見表1。

表1 骨折愈合不同時(shí)期MDA含量比較(±s，nmol/mL，n=10)

表1 骨折愈合不同時(shí)期MDA含量比較(±s，nmol/mL，n=10)

7 d 14 d A組(模型組)組別6.24±0.14 4.45±0.13 B組(茶多酚干預(yù)組)5.12±0.181)4.43±0.203)C組(茶多酚防治組)4.51±0.152)4.42±0.173)注:1)與A組比較，P＜0.05;2)與B組比較，P＜0.05; 3)與A組比較，P＞0.05

2.2骨折愈合不同時(shí)期SOD測(cè)量結(jié)果在造模后第7天，B組SOD含量均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);C組SOD含量高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。造模后第14天，B組、C組SOD含量與A組相近，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳細(xì)資料見表2。

2.3骨折不同愈合時(shí)期骨痂厚度測(cè)量結(jié)果在造模后第7天，B組的骨痂厚度高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);C組的骨痂厚度與B組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在造模后第14天，B組的骨痂厚度高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);C組的骨痂厚度與B組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，詳細(xì)資料見表3。

組別7 d 14 d A組(模型組)56.95±2.25 85.60±2.43 B組(茶多酚干預(yù)組)68.10±2.951)86.78±2.203)C組(茶多酚防治組)88.85±3.162)88.17±3.173)注:1)與A組比較，P＜0.05;2)與B組比較，P＜0.05; 3)與A組比較，P＞0.05

表3 骨折愈合不同時(shí)期骨痂厚度結(jié)果比較(s，mm，n=10)

表3 骨折愈合不同時(shí)期骨痂厚度結(jié)果比較(s，mm，n=10)

7 d 14 d A組(模型組)組別1.05±0.10 1.85±0.15 B組(茶多酚干預(yù)組)1.36±0.211)2.30±0.243)C組(茶多酚防治組)1.40±0.182)2.32±0.223)注:1)與A組比較，P＜0.05;2)與B組比較，P＜0.05; 3)與A組比較，P＞0.05

3 討論

氧化應(yīng)激是指生物體在衰老或遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如氧自由基和氮自由基產(chǎn)生過多，體內(nèi)氧化系統(tǒng)及與抗氧化系統(tǒng)失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，從而導(dǎo)致組織損傷。氧化應(yīng)激是體內(nèi)自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面效應(yīng)，被認(rèn)為是衰老和疾病的重要原因之一［4］。近年，氧化應(yīng)激與骨質(zhì)疏松的關(guān)系成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，氧化應(yīng)激是增齡性骨丟失的一個(gè)重要原因，其機(jī)制可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡［2-3］。臨床實(shí)驗(yàn)方面，Ostman等［5］經(jīng)研究證實(shí)氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致老年男性骨密度降低，是骨質(zhì)疏松發(fā)生的一個(gè)重要原因。D'ameli等［6］通過研究也認(rèn)為氧化應(yīng)激是絕經(jīng)后婦女骨丟失、骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。文獻(xiàn)報(bào)道，茶多酚正是由于其有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激能力，能夠減少骨丟失，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用［3，7］。筆者因此推測(cè)，茶多酚或可通過抑制骨折導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減少骨丟失，促進(jìn)骨折愈合。本研究中，造模后第7、14天，茶多酚干預(yù)組和茶多酚防治組骨痂厚度均明顯高于模型組，說明茶多酚確有促進(jìn)骨折愈合的作用，驗(yàn)證了筆者的推測(cè)。

外傷(包括骨折)是導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激發(fā)生的重要原因之一［8-10］。彭玉蘭等［10］通過對(duì)兒童骨折患者氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在骨折發(fā)生1周內(nèi)，氧化應(yīng)激指標(biāo)水平較正常對(duì)照組有明顯差異，2周后氧化應(yīng)激指標(biāo)水平與正常對(duì)照組相近，說明在骨折發(fā)生初期患兒機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，但隨著機(jī)體的自我修復(fù)，2周后體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)基本解除。氧化應(yīng)激是影響成骨細(xì)胞功能的重要原因之一［11-12］，不利于骨折的修復(fù)。因此筆者推測(cè)在骨折愈合早期，茶多酚可通過其抗氧化作用抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到促進(jìn)骨折愈合的作用。到了骨折愈合的中后期，由于機(jī)體有自我修復(fù)能力，氧化應(yīng)激狀態(tài)自動(dòng)解除，茶多酚不再發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。MDA和SOD都是重要的氧化應(yīng)激指標(biāo)，MDA是氧自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平間接反映了氧自由基的水平［13］; SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其水平降低提示機(jī)體抗氧化能力受損。本研究通過檢測(cè)MDA和SOD來評(píng)估骨折愈合不同時(shí)期大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。造模后第7天，茶多酚干預(yù)組和茶多酚防治組大鼠血液中的MDA含量均低于模型組、SOD含量均高于模型組，說明該時(shí)期茶多酚抑制了大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng);造模后第14天，茶多酚干預(yù)組、茶多酚防治組與模型組的MDA含量和SOD含量相近，說明該時(shí)期茶多酚的抗氧化性不再發(fā)揮主要作用。此結(jié)果與上述推測(cè)一致。

綜上所述，茶多酚在大鼠骨折愈合早期有一定促進(jìn)作用，其機(jī)制與茶多酚的抗氧化作用密切相關(guān);在骨折愈合中后期，隨著機(jī)體的自身修復(fù)，茶多酚的抗氧化作用不再發(fā)揮主要作用。茶多酚促進(jìn)骨折愈合的其他可能機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Im pact Caused by Antioxidant Effect of Tea Polyphenols in Fracture Healing of Rats

Zhuang Linbo，Wang Lisheng，Yu Fei，et al

(Department of Orthopedics，Central Hospital of Bao'an，Shenzhen 518102，China)

Objective To explore the impact caused by the antioxidant effect of tea polyphenols in fracture healing of rats.Methods 60 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups，20 rats in each group.Group A was the model group，the fracture healing model was made on the right tibia in rats;Group B was treated with tea polyphenols after the fracture healing model was made;Group C was given tea polyphenols either before or after the fracture healing model was made.Tea polyphenols was given orally 1.0 g/kg each day.Respectively on the 7th and 14th day after modeling，10 rats were executed randomly in each group.Malondialdehyde and superoxide dismutase in serum was tested.Callus which was collected from the right tibia of rats，was made into slices.Thickness of the slices was measured.Results On the 7th day after modeling，compared with Group A，the level of malondialdehyde was lower，superoxide dismutase was higher and thickness of callus was higher for Group B and Group C，especially Group C changed more significantly.On the 14th day after modeling，the level ofmalondialdehyde and superoxide dismutase was almost at the same level among these three groups，the thickness of callus for Group B and Group C was higer than Group A.Conclusion Tea polyphenols can make promoting effect during the early period of the fracture healing process in rats，its mechanism is related to the antioxidant effect of tea polyphenols closely.

tea polyphenols;antioxidant effect;fracture healing;oxidative stress;rats

R322.7+1

A

2015-08-26

莊林波(1982-)，男，主治醫(yī)師，廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳寶安區(qū)中心醫(yī)院骨科，518102。

1008-5572(2016)01-0033-03

深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014145)