袁琳慧，王迪，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

穿心蓮和水飛薊抑制MRSA41577外排系統(tǒng)的作用機(jī)制

袁琳慧?，王迪?，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116081)

目的 研究穿心蓮和水飛薊抑制MRSA41577外排系統(tǒng)的作用機(jī)制。方法 通過熒光分光光度法檢測(cè)穿心蓮和水飛薊為MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制劑；通過PCR的方法檢測(cè)MRSA41577的norA外排基因；通過RT-PCR的方法檢測(cè)穿心蓮和水飛薊對(duì)外排基因norA表達(dá)量的影響。結(jié)果 穿心蓮和水飛薊處理MRSA41577后，環(huán)丙沙星在菌體內(nèi)的的蓄積量隨著藥物處理時(shí)間的增加而增加，當(dāng)藥物處理菌體12 min后，與對(duì)照組相比，菌體內(nèi)環(huán)丙沙星蓄積量分別增加49%和76%(P<0.05)，其作用效果優(yōu)于陽性對(duì)照利血平。MRSA41577菌株內(nèi)含有norA外排基因。穿心蓮和水飛薊能降低norA基因表達(dá)量，與對(duì)照組相比，norA的相對(duì)表達(dá)量分別降低了35%和42%(P<0.05)。結(jié)論 穿心蓮和水飛薊抑制MRSA41577外排系統(tǒng)的作用機(jī)制是通過減少norA外排基因的表達(dá)量，進(jìn)而抑制外排蛋白的合成，阻止藥物的外排使菌體重新恢復(fù)對(duì)藥物的敏感性。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；外排系統(tǒng)；norA；作用機(jī)制

隨著對(duì)細(xì)菌耐藥性研究的深入，目前認(rèn)為主動(dòng)外排系統(tǒng)是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的重要機(jī)制[1-2]。主動(dòng)外排系統(tǒng)是廣泛分布于菌體細(xì)胞膜表面上的一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能夠讓進(jìn)入到膜內(nèi)的藥物直接被泵出體外，使細(xì)胞內(nèi)抗生素等藥物的含量降低而產(chǎn)生耐藥[3]，這些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由相關(guān)外排基因調(diào)控，如norA和qacA/B等[4]。其中norA是金黃色葡萄球菌的固有外排基因，當(dāng)受到環(huán)丙沙星等藥物的刺激誘導(dǎo)時(shí)，可通過增加該基因的表達(dá)量，使其編碼的外排蛋白增多，從而將進(jìn)入膜內(nèi)的藥物泵出膜外使其產(chǎn)生耐藥[5-7]。近年研究表明，很多中藥能夠抑制MRSA的外排系統(tǒng)，是MRSA良好的外排泵抑制劑[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期從24種中藥中篩選到穿心蓮和水飛薊2種中藥對(duì)MRSA的外排系統(tǒng)具有抑制作用。本文擬通過檢測(cè)穿心蓮和水飛薊2種藥物對(duì)菌體內(nèi)環(huán)丙沙星蓄積量的影響，以及對(duì)外排基因norAmRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，探討其抑制MRSA外排系統(tǒng)的作用機(jī)制，旨在為將其開發(fā)成外排系統(tǒng)抑制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA41577，由大連市中心醫(yī)院提供。本文前期通過頭孢西丁紙片證明其為耐藥菌株。

1.1.2 主要試劑：穿心蓮(Andrographis paniculata，AP)和水飛薊(silybum marianum，SM)由遼寧師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室提供；利血平購自大連諾威信生物技術(shù)有限公司；甘氨酸、環(huán)丙沙星(CIP)購自上海生工生物有限公司；引物及PCR反應(yīng)液購自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥穿心蓮和水飛薊提取物制備方法：稱取一定量的穿心蓮和水飛薊中藥，用索氏提取器以95%的乙醇熱回流提取8 h后將提取液濃縮制成干粉。精確稱取一定量的干粉，用無水乙醇配制成一定濃度的母液，0.22 μm濾器過濾后備用。

1.2.2 環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[9]：精確稱取一定量的環(huán)丙沙星粉末，用0.1M甘氨酸(pH=3)配制成濃度分別為0.4、0.8、1、2、4、6、8、10、12、14 mg/L的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)液。于454 nm發(fā)射波長和382 nm激發(fā)波長下測(cè)定環(huán)丙沙星的熒光值，以環(huán)丙沙星的濃度為橫坐標(biāo)，熒光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 環(huán)丙沙星蓄積動(dòng)力學(xué)測(cè)定[9]：用終濃度為16 mg/mL的穿心蓮和水飛薊處理MRSA41577 16 h后，離心收集菌體，PBS(pH=7.0)洗滌3次后，用PBS將其重新懸浮，37 ℃孵育10 min后加入環(huán)丙沙星，使其終濃度為20 μg/mL。待作用4、8、12 min后，分別取0.5 mL菌液，離心收集菌體，然后加入1 mL pH3.0的鹽酸甘氨酸，25 ℃溫浴2 h后離心，取上清液于454 nm發(fā)射波長和382 nm激發(fā)波長下測(cè)定熒光值，以加20 mg/L利血平為陽性對(duì)照，不加藥組為空白對(duì)照。

1.2.4 MRSA41577norA外排基因的檢測(cè)：提取模板DNA，根據(jù)GenBank中已發(fā)布的金黃色葡萄球菌的基因序列，利用Primer 5.0軟件及參考有關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)norA基因引物，norA擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)測(cè)長度分別為435 bp。然后用進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，后用Gel-Pro Analyzer Version3.1凝膠成像儀進(jìn)行分析。norA產(chǎn)物長度435 bp，序列如下：

上游引物5’-GTT ACT TGT TGC TGC TTT TG-3’

下游引物5’-GCT TGT CGT AGA CTT TTT CG-3’

1.2.5 穿心蓮和水飛薊對(duì)norA外排基因表達(dá)量的影響[10]：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的MRSA41577菌懸液分別接種到含終濃度為32 mg/mL的穿心蓮和水飛薊的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，120 rpm培養(yǎng)16 h；取4～6 mL MRSA41577菌懸液，4 ℃，12000 r/min離心1 min，采用Trizol法提取菌體總RNA，使用微量核酸測(cè)量儀進(jìn)行RNA濃度的定量，然后采用兩步法反轉(zhuǎn)合成模板cDNA。根據(jù)設(shè)計(jì)合成的norA引物進(jìn)行擴(kuò)增，以16S RNA為內(nèi)參基因，待反應(yīng)結(jié)束后分析RT-PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，并計(jì)算norA基因的相對(duì)表達(dá)量，以不加藥物組為空白對(duì)照。norA引物長度為21 bp，16S引物長度為21 bp，序列如下：

norA上游引物5GAGTGCTGGTATGGTAAT-GCC3下游引物5CCCTGGTCCTAAAATGAATCC316S上游引物5GCTCGTGTCGTGAGATGTT-GG3下游引物5TTTCGCTGCCCTTTGTATTGT3

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮和水飛薊對(duì)MRSA41577體內(nèi)環(huán)丙沙星蓄積量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星在0.2～14 mg/L濃度間其熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系。見圖1。

蓄積量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穿心蓮和水飛薊能夠增加 MRSA41577 菌體內(nèi)環(huán)丙沙星的蓄積量，且呈時(shí)間依賴。當(dāng)穿心蓮和水飛薊作用菌體12 min后，菌體內(nèi)環(huán)丙沙星蓄積量與對(duì)照組相比分別增加了49%和76%(P<0.05)，作用效果優(yōu)于陽性對(duì)照利血平。見圖2。

圖1 環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ciprofloxacin

圖2 穿心蓮和水飛薊對(duì)環(huán)丙沙星蓄積量的影響*P<0.05，與對(duì)照組比較Fig.2 Effect of AP and SM accumulation of ciprofloxacin*P<0.05，compared with control group

2.2 外排基因norA的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在MRSA41577菌株中檢測(cè)到norA外排基因，推測(cè)穿心蓮和水飛薊抑制MRSA41577的外排作用與norA外排基因有關(guān)。見圖3。

圖3 MRSA41577 norA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel picture of norA gene of MRSA41577

2.3 穿心蓮和水飛薊對(duì)MRSA 414577norA外排基因表達(dá)量的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，穿心蓮和水飛薊能夠顯著降低MRSA 414577norA外排基因表達(dá)量，當(dāng)穿心蓮和水飛薊與MRSA41577作用 16h后，其norA的表達(dá)量與對(duì)照組比較分別降低35%和42%(P<0.05)。見圖4。

圖4 穿心蓮和水飛薊對(duì)MRSA41577 norA表達(dá)量的影響*P<0.05，與對(duì)照組比較Fig.4 Effect of APand SM relative norA expression of MRSA41577.*P<0.05，compared with control group

3 討論

主動(dòng)外排系統(tǒng)是分布于菌體細(xì)胞膜表面上的組膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其種類豐富，功能各異，由相關(guān)外排基因表達(dá)產(chǎn)生[11-13]。其中norA是金黃色葡萄球菌主要的多藥外排蛋白，由位于染色體上的norA基因編碼，是金黃色葡萄球菌的結(jié)構(gòu)基因。在正常表達(dá)情況下不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥，但受到環(huán)丙沙星等藥物的刺激誘導(dǎo)后，其表達(dá)量明顯增加，最終因norA蛋白的增多而將進(jìn)入膜內(nèi)的藥物泵出膜外[14-15]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穿心蓮和水飛薊能顯著提高環(huán)丙沙星在MRSA41577菌體內(nèi)的蓄積量，與對(duì)照組相比環(huán)丙沙星在菌體內(nèi)的蓄積量分別增加了49%和76%(P<0.05)，其作用效果優(yōu)于陽性對(duì)照利血平，表明穿心蓮和水飛薊是MRSA41577 的外排泵抑制劑。RT-PCR結(jié)果顯示，穿心蓮和水飛薊可以顯著降低norA基因的表達(dá)量，與對(duì)照組相比分別降低35%和42%(P<0.05)，其作用效果與陽性對(duì)照利血平相當(dāng)。

綜上所述，水飛薊和穿心蓮是MRSA41577良好的外排泵抑制劑，其作用機(jī)制是通過抑制外排基因norA的表達(dá)量，減少norA外排蛋白的量，使菌體抑制藥物外排，以提高環(huán)丙沙星等藥物在MRSA41577菌體內(nèi)的蓄積量，逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性。

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(編校：苗加會(huì))

Inhibitory effects of andrographis paniculata and silybum marianum on the efflux pump of MRSA 41577

YUAN Lin-hui?, WANG Di?, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ

(School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province,Dalian 116081, China)

ObjectiveTo study the inhibitory effects of andrographis paniculata and silybum marianum on the efflux system of MRSA 41577.MethodsInhibitory effects of andrographis paniculata and silybum marianum on efflux system of MRSA 41577 was evaluated using fluorescence spectrophotometry. PCR was applied to detect thenorAefflux gene.By RT-PCR method for detection of andrographis paniculata and silybum marianum influence of the expression ofnorAefflux gene.ResultsAndrographis paniculata and silybum marianum significantly increased the accumulation of ciprofloxacin in MRSA 41577 in a time-dependent manner. At 12 minute, andrographis paniculata and silybum marianum respectively increased ciprofloxacin in MRSA41577 by 49% and 76%(P<0.05), which is superior to that of reserpine. Further mechanism studies indicated that andrographis paniculata and silybum marianumcould reduce the expression ofnorAin MRSA 41577. After incubated with andrographis paniculata and silybum marianum for 16 h, the relative expression ofnorAof MRSA41577 was respectively reduced by 35% and 42%(P<0.05).ConclusionAndrographis paniculata and silybum marianumcould inhibit MRSA efflux system through reducing pathogen ’s expression ofnorAand NorA protein.

MRSA; efflux system;norA; mechanism of action

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.007

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L201683675)；遼寧省自然科學(xué)基金(201602462)；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610165042)

袁琳慧，女，本科，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：2318446277@qq.com；王迪，共同第一作者，女，碩士在讀，研究方向：微生物生化，E-mail：momoxiaodi@sina.com；謝明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

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