邢琳，張秀華，釗倩倩，劉飛,Δ，顏震，陳勉，侯重文，朱希強,，凌沛學

(1.濟南市第四人民醫(yī)院，山東 濟南 250101；2.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；3.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101)

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的高效表達及酶法制備AA-2G條件優(yōu)化

邢琳1，張秀華2，釗倩倩2，劉飛2,3Δ，顏震2，陳勉2，侯重文2，朱希強2,3，凌沛學3

(1.濟南市第四人民醫(yī)院，山東 濟南 250101；2.山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；3.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101)

目的 構建分泌表達α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-Cyclodextrin Glycosyltransferase,α-CGTase)的重組菌株，并利用該酶液制備AA-2G。方法 經(jīng)PCR擴增浸麻芽孢桿菌154基因組獲得α-CGTase基因序列，將該基因序列和pET26b載體分別經(jīng)Nco I、Xho I雙酶切后用T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。利用發(fā)酵培養(yǎng)基分泌表達α-CGTase，利用該酶和淀粉糊精、維生素C反應制備AA-2G，并進行制備條件優(yōu)化。結果 在大腸桿菌中實現(xiàn)了α-CGTase的胞外分泌表達，胞外環(huán)化酶活力達到120 U/mL，利用該酶的轉(zhuǎn)糖基反應將淀粉糊精、維生素C轉(zhuǎn)化為AA-2G，經(jīng)HPLC檢測正確。結論 利用自制α-CGTase得到了AA-2G，通過制備條件優(yōu)化AA-2G產(chǎn)量為17.46 g/L，轉(zhuǎn)化率達到58.2%(mg/mg)。

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；大腸桿菌；維生素C； AA-2G；酶法轉(zhuǎn)化

維生素C(Vitamin C，VC)又叫L-抗壞血酸(L-ascorbic acid，L-AA)，是一種水溶性維生素，在人體中發(fā)揮著重要的作用。VC是一種很好的抗氧化劑，對人體正常細胞有保護作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)VC水平低下與腫瘤的發(fā)生密切相關[1]，高濃度的VC可以抑制、殺傷腫瘤細胞[2-4]，藥理濃度的VC對卵巢癌、宮頸癌[5]、乳腺癌[6]、大腸癌、非霍奇金淋巴瘤、腎細胞癌、前列腺癌、膀胱癌等都具有一定的治療作用[7-9]。此外，VC在氨基酸代謝、細胞間質(zhì)合成、血液凝固、調(diào)節(jié)血脂等方面也發(fā)揮著重要作用[10]。但是VC本身不穩(wěn)定，其分子中2位和3位碳原子上的烯醇式羥基極易被氧化解離，使VC喪失還原活性，從而限制了其應用。VC是目前世界上消耗量最大的藥物原材料，因此開發(fā)性能穩(wěn)定的VC衍生物成為了研究的熱點。

VC衍生物主要有金屬鹽類衍生物、酯類衍生物、葡萄糖衍生物[11]，其中2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)因其強穩(wěn)定性、高安全性而備受關注。AA-2G進入人體后可被體內(nèi)α-葡萄糖苷酶分解為VC與D-葡萄糖，使VC可以在體內(nèi)保持有活性的烯醇式結構，是VC的最佳替代品，目前廣泛應用于化妝品、食品、醫(yī)療保健及畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)[12]。AA-2G的化學合成法非常困難且成本高，目前應用最廣泛的是生物合成法，即利用α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等糖基轉(zhuǎn)移酶將供體上的D-吡喃葡萄糖基轉(zhuǎn)移到VC的2-碳位羥基集團，脫水生成AA-2G。

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-Cyclodextrin Glycosy-ltransferase，α-CGTase)是糖基水解酶α-淀粉酶家族13成員，是一種微生物所產(chǎn)的胞外酶[13]?？梢源呋?種不同的反應，包括3種轉(zhuǎn)糖基化反應(歧化反應、環(huán)化反應、偶合反應)和水解反應[14]，其中環(huán)化反應是α-CGTase的特征反應，制備AA-2G也是利用此特征反應。本課題組前期利用大腸桿菌熱激誘導成功表達α-CGTase，但是在胞內(nèi)表達，并且表達量較低[15]。本研究旨在通過構建大腸桿菌分泌表達系統(tǒng)，制備可溶性α-CGTase，并利用該酶及淀粉制備AA-2G，以降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株:pET26b質(zhì)粒，E.coliTop10，BL21(DE3)，Bacillusmacerans154均為本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基:液體LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；固體LB培養(yǎng)基含1.5%～2%瓊脂粉。TB培養(yǎng)基(g/L)：甘油 1，胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 1，酵母粉 2，磷酸氫二鉀 13.5，磷酸氫二銨 4，檸檬酸 1.7，微量元素液10 mL/L；補料培養(yǎng)基(g/L)：甘油500，硫酸鎂 10，蛋白胨 10，酵母粉20。

1.1.3 試劑：限制性內(nèi)切酶(NcoI，XhoI)、T4 DNA連接酶、Protein Marker、PfuDNA 聚合酶(Fermentas)、Kan；PCR引物、DNA Marker、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；糖化酶、α-環(huán)糊精(上海生工生物工程有限公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.1.4 實驗儀器:Bio-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell SDS-PAGE電泳槽，DYCP-40C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，三層搖床Ampere chart Mnltitron II(伊孚森生物技術中國有限公司)，Eppendorf AG 22331 PCR儀，Thermo Micro7/21R離心機，TECAN Sunrise-Basic Tecan酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 BL21-pET26-CGT表達菌株的構建:根據(jù)已知α-CGTase成熟肽編碼序列設計上下游引物，從實驗室保存的浸麻芽孢桿菌菌株Bacillusmacerans154中擴增α-CGTase基因序列。α-CGTase成熟肽編碼序列全長2 064 bp，在其N端連接pET26b自身帶有的pelB信號肽，上下游分別添加NcoI、XhoI酶切位點便于和載體相連，設計引物如下：

上游引物：5’-CATGCCATGGTCACCCGATACGAGCGTGG-3’

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAATTTTGCCAGTCCACC-3’

將PCR擴增得到的α-CGTase基因片段和pET26載體分別用限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI進行雙酶切，并切膠回收純化。純化后的載體和片段利用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，獲得pET26-CGT重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR和NcoI、XhoI雙酶切驗證正確的質(zhì)粒送測序公司測序，測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，獲得表達載體BL21-pET26-CGT。

1.2.2 α-CGTase的分泌表達及酶活測定:將在搖瓶中篩選得到的酶活較高的菌株用1 L發(fā)酵罐發(fā)酵，所用種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，待種子液生長至OD約為3.0時上罐，利用發(fā)酵培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵表達，控制發(fā)酵液pH為6.7。待發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分消耗完全出現(xiàn)補料信號時加入補料培養(yǎng)基繼續(xù)表達，并加入終濃度為1 mM IPTG誘導，加入甘氨酸促進蛋白向胞外分泌。每6 h取樣，測定胞外酶活并進行SDS-PAGE電泳，檢測胞外目的蛋白表達情況。

α-CGTase的酶活測定采用甲基橙法，測定酶活力為環(huán)化活力。配制10 μM α-環(huán)糊精作為標準溶液，取無菌EP管，分別加入0、20、40、60、80、100 μL標準溶液，加入50 mM(pH=6.0)磷酸緩沖液補足至每管100 μL，分別加入100 μL 0.1 M HCl溶液，100 μL甲基橙溶液，室溫放置20 min顯色，492 nm處測定吸光度，以α-環(huán)糊精含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。另取10 μL適當稀釋的酶液，加入90 μL 3%的可溶性淀粉，40 ℃反應10 min，反應結束后立即將樣品置于冰上，冷卻后加入100 μL HCl溶液、100 μL甲基橙溶液，室溫放置20 min顯色，測定492 nm吸光度。根據(jù)標準曲線方程計算出粗酶液酶活。

1.2.3 酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G:在500 mL反應體系中加入2%VC、4%自制淀粉糊精及10%的自制粗酶液(4 500～5 500 U)混勻，加入0.1 M Ca2+，調(diào)整反應液pH為5.4，42 ℃下避光反應72 h，進行轉(zhuǎn)糖基反應。反應結束后加入1 mg/mL糖化酶繼續(xù)反應24 h，將AA-2Gn轉(zhuǎn)化為AA-2G。反應結束后將樣品離心，取上清液，0.45 μm超濾膜過濾后同AA-2G標準品、VC標準品一起進行HPLC檢測。HPLC檢測AA2G條件為：Agilent 1200 series HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，紫外檢測器，流動相為含1 mM四戊基溴化銨、10 mM H3PO4的10%甲醇溶液，流速0.5 mL/min，標準品濃度為1 mg/mL，柱溫35 ℃，在238 nm處檢測。

1.2.4 酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G條件優(yōu)化

① 轉(zhuǎn)糖基反應溫度對AA-2G產(chǎn)量的影響：按1.2.3中所述AA-2G制備方法，調(diào)整轉(zhuǎn)糖基反應溫度分別為37 ℃、40 ℃、42 ℃，其他條件不變，反應結束后HPLC檢測溶液中AA-2G產(chǎn)量。

② α-CGTase濃度對AA-2G產(chǎn)量的影響：按1.2.3中所述AA-2G制備方法，調(diào)整自制α-CGTase粗酶液加入量分別為10%、20%、30%、40%，其他條件不變，反應結束后HPLC檢測溶液中AA-2G產(chǎn)量。

③ 淀粉糊精加入量對AA-2G產(chǎn)量的影響：按1.2.3中所述AA-2G制備方法，調(diào)整淀粉糊精加入量(淀粉和VC加入比例為2:1)分別為4%、5%、6%，其他條件不變，反應結束后HPLC檢測溶液中AA-2G產(chǎn)量。

④ 反應時間對AA-2G產(chǎn)量的影響：按1.2.3中所述AA-2G制備方法，調(diào)整轉(zhuǎn)糖基時間分別為72、96、120 h，其他條件不變，反應結束后HPLC檢測溶液中AA-2G產(chǎn)量。

2 結果

2.1 pET26-CGT重組菌的構建 pET26-CGT重組質(zhì)粒與pET26b空質(zhì)粒分別經(jīng)酶切及PCR驗證結果如圖1所示。pET26b空質(zhì)粒大小為5 360 bp，重組質(zhì)粒大小約為7 424 bp，單酶切后對應條帶位置與理論值相一致。目的基因片段大小為2 064 bp，經(jīng)PCR擴增重組質(zhì)粒得到片段大小與重組質(zhì)粒雙酶切所切下片段大小一致，均在2 000 bp附近，與理論值相符，而空質(zhì)粒對照無此條帶，說明目的基因片段成功插入載體中，pET26-CGT重組質(zhì)粒構建成功。

圖1 pET26-CGT重組質(zhì)粒酶切及PCR驗證結果Lane 1：DNA Marker；Lane 2：pET26-CGT重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I單酶切；Lane 3：pET26b 空質(zhì)粒經(jīng)Xho I單酶切；Lane 4：pET26-CGT重組質(zhì)粒經(jīng)Nco I、Xho I雙酶切；Lane 5：pET26b空質(zhì)粒經(jīng)Nco I、Xho I雙酶切；Lane 6：pET26-CGT重組 質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增；Lane 7：pET26b空質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增Fig.1 Single and double-digested and PCR validation of recombinant pET26-CGTLane 1:DNA Marker;Lane 2:Single digested of pET26-CGT by Xho I;Lane 3:Single digested of pET26b by Xho I;Lane 4:Double digested of pET26-CGT by Xho I and Nco I;Lane5:Double digested of pET26b by Xho I and Nco I;Lane 6:PCR validation of recombinant pET26-CGT;Lane 7:PCR validation of pET26b

2.2 α-CGTase的分泌表達及酶活測定 α-CGTase 在發(fā)酵培養(yǎng)基中的表達情況如圖2，發(fā)酵46 h胞外檢測到α-CGTase條帶，分子量約為74 kD，與理論分子量一致，隨著發(fā)酵時間的延長胞外酶表達量也隨之升高。通過甲基橙法測定酶環(huán)化活力結果如圖3所示，同表達結果相對應，46 h樣品中開始檢測到酶活，隨著表達時間的延長胞外酶活也隨之升高，最高達到120 U/mL。

圖2 α-CGTase胞外表達情況Lane 1：蛋白分子量Marker；Lane 2～8：表達40、46、52、64、 70、76、82 h發(fā)酵上清中目的蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of α-CGTaseLane 1:Protein molecular weight Marker; Lane 2-8: Expression of α-CGTase in culture medium at 40, 46, 52, 64, 70, 76, 82 h

圖3 α-CGTase胞外酶活Fig.3 Extracellular enzyme activity of α-CGTase

2.3 酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G 利用自發(fā)酵酶液和自制淀粉糊精制備的樣品和標準品一起經(jīng)HPLC檢測分析，結果如圖4所示。結果顯示AA-2G標準品在6.8 min出峰，VC標準品在6.37 min出峰，樣品在兩處均有峰出現(xiàn)。6.8 min處峰為AA-2G，說明用自制酶液和淀粉糊精制備得到了AA-2G；6.37 min處小峰，說明仍有少量VC沒有完全轉(zhuǎn)化，可在純化時將其去除。

圖4 AA-2G高效液相色譜圖Fig.4 HPLC analysis of AA-2G

2.4 酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G條件優(yōu)化 酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G條件優(yōu)化結果如圖5，α-CGTase的最適反應溫度為40 ℃，溫度過高或過低都會使酶活降低，影響AA-2G的轉(zhuǎn)化。而隨著α-CGTase濃度的增高，AA-2G的產(chǎn)量先增高后降低，本著利益最大化的原則，最后選擇加入20%反應體系體積的自制酶液。隨著淀粉加入量的增加，AA-2G產(chǎn)量也隨之增加，但是隨著淀粉量的增加，淀粉糊精制備更加困難，因此選定在最終反應體系中加入6%自制糊化淀粉、3%抗壞血酸。反應時間對AA-2G產(chǎn)量也有一定的影響，反應時間延長，AA-2G產(chǎn)量也相應增加，但到達96 h后產(chǎn)量增加不再明顯，因此選定轉(zhuǎn)糖基反應時間為96 h。

圖5 酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of AA-2G condition by biotransformation

優(yōu)化后的制備條件為使用3%抗壞血酸、6%自制糊化淀粉、20%反應體系體積的自制酶液、0.1 M Ca2+，在pH 5.4、40 ℃、避光隔氧、200 r/min震蕩條件下反應120 h。轉(zhuǎn)糖基反應結束后加入1 mg/mL的糖化酶，水解反應1 h。得到的最終反應液中AA-2G濃度為17.46 g/L，AA2G轉(zhuǎn)化率為58.2%(mg/mg)。

3 討論

本研究中利用pET26b質(zhì)粒及其自身所帶pelB信號肽，使α-CGTase在大腸桿菌中實現(xiàn)了分泌表達，發(fā)酵過程中誘導劑的加入及甘氨酸的添加促進了α-CGTase的胞外分泌[16]，發(fā)酵結束時胞外粗酶液酶活達到120 U/mL。李彬[17]在大腸桿菌中表達α-CGTase，胞外粗酶液酶活為48 U/mL。張佳瑜[18]在枯草桿菌中表達α-CGTase，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后胞外酶活為30 U/mL。李兆豐[16]在大腸桿菌中表達α-CGTase，并添加甘氨酸，胞外酶活僅為35.5 U/mL。本研究中利用pelB信號肽引導分泌的α-CGTase表達量達到了較高水平。

利用該酶和淀粉、維生素C經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化制備AA-2G，經(jīng)HPLC驗證反應液中樣品與標準品出峰時間一致，證實轉(zhuǎn)化得到了AA-2G。韓瑞枝[19]利用α-CGTase轉(zhuǎn)化生產(chǎn)AA-2G的產(chǎn)量為2.12 g/L。本研究中經(jīng)條件優(yōu)化后反應液中AA-2G濃度為17.46 g/L，AA2G轉(zhuǎn)化率達到58.2%(mg/mg)。

α-CGTase是AA-2G制備中最關鍵的一種酶，但目前市場上該酶價格昂貴，本研究利用大腸桿菌分泌表達的α-CGTase粗酶液和淀粉糊精制備了AA-2G，該法可應用于大規(guī)模生產(chǎn)，不僅降低了生產(chǎn)成本，且轉(zhuǎn)化效率高。后續(xù)研究將對AA-2G的純化條件進行優(yōu)化，以得到純化成本低、純度高的AA-2G樣品。

[1] Konstantin S,Kazimierz SK.Ascorbate depletion:a critical step in nickel carcinogenesis[J].Environ Health Perspect,2005,113(5):577-584.

[2] 李能，周波，陳忠東.維生素C對Hela細胞系增殖及細胞周期的影響[J].南華大學學報(醫(yī)學版)，2004，32(2)：161-163.

[3] 李媛，李晶晶，胡本容，等.三氧化二砷和維生素C 聯(lián)合誘導肝癌細胞凋亡的作用研究[J].醫(yī)藥導報，2006，1(25)：3-5.

[4] Verrax J,Cadrobbi J,Delvaux M,et al.The association of vitamins C and K3 kills cancer cells mainly by autoschizis ,a novel form of cell death Basis for their potential use as coadjuvants in anticancer therapy[J].Eur J Med Chem,2003,38(5):451-457.

[5] 曹娟，鄭杰，盧航青.維生素C與宮頸癌Hela細胞凋亡關系的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009，17(6)：1017-1021.

[6] Vollbracht C,Schneider B,Leendert V,et al.Intravenous vitamin C administration improves quality of life in breast cancer patients during chemo-radiotherapy and aftercare:results of a retrospective,multicentre,epidemiological cohort study in Germany[J].In Vivo,2011,25(6):983-990.

[7] 劉祚仁，郭塨.維生素C抗癌作用的臨床試驗研究進展[J].醫(yī)學綜述，2014，20(13)：2358-2360.

[8] Riordan HD,Riordan NH,Jackson JA,et al.Intravenous vitamin C as a chemotherapy agent:a report on clinical cases[J].P R Health Sci J,2004,23(2):115-118.

[9] Padayatty SJ,Riordan HD,Hewitt SM,et al.Intravenously administered vitamin C as cancer therapy:three cases[J].CMAJ,2006,174(7):937-942.

[10] 錢燕春，馮德云.維生素C防治腫瘤作用的研究進展[J].右江醫(yī)學，2008，36(6)：741-743.

[11] Dresser GK,Wacher V,Wong S,et al.Evaluation of peppermint oil and ascorbyl palmitate asinhibitors of cytochrome P4503A4 activity in vitro and in vivo[J].Clinical Pharmacology & Therapeutics,2002,72(3):247-255.

[12] Wang ZK,Qi QS,Wang PG.Engineering of cyclodextrin glucanotransferase on the cell surface of Saccharomyces cerevisiae for improved cyclodextrin production[J].Appli Environ Microb,2006,72 (3):1873-1877.

[13] Tonkova A.Bacterial cyclodextrin glucanotransferase[J].Enzyme and Microb Tech,1998,22:678-686.

[14] Vander Veen BA,Alebeek GJ,Uitdehaag JC,et al.The three transglycosylation reactions catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans (strain 251) proceed via different kinetic mechanisms [J].Eur J Biochem/ FEBS,2000,267(3):658-665.

[15] 王曉玉，劉飛，顏震，等.浸麻芽孢桿菌環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶的克隆與表達[J].中國生化藥物雜志，2012，33(1)：46-48.

[16] 李兆豐.軟化類芽孢肝菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的表達及其產(chǎn)物特異性分析[D].無錫：江南大學，2009.

[17] 李彬.軟化芽胞桿菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中胞外分泌的優(yōu)化 [D].無錫：江南大學，2010.

[18] 張佳瑜.軟化芽孢肝菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在畢赤酵母和枯草桿菌中的表達[D].無錫：江南大學，2010.

[19] 韓瑞枝.環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的分子改造及合成糖基化L-抗壞血酸 [D].無錫：江南大學，2013.

(編校：吳茜)

High level expression of α-CGTase and optimize biotransformation conditions of AA-2G

XING Lin1, ZHANG Xiu-hua2, ZHAO Qian-qian2, LIU Fei2Δ, YAN Zhen2, CHEN Mian2, HOU Zhong-wen2,ZHU Xi-qiang2,3, LING Pei-xue3

(1.The NO.4 People’ Hospital of Ji’nan City, Ji’nan 250101, China; 2.Shandong Academy of Pharmaceutical Science, Key Laboratory of Biopharmaceuticals, Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs, National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs, Ji’nan 250101, China; 3.Shandong Freda Pharmaceutical Group Corporation, Ji’nan 250101, China)

ObjectiveTo construct a prokaryotic expression vector in BL21 to secretorily express α-Cyclodextrin Glycosyltransferase(α-CGTase).Methodsα-CGT gene was amplified fromBacillusmacerensgenome by PCR.pET26b and α-CGT gene were connected after digested withNcoI,XhoI respectivly, and then transformed intoEscherichiacoliBL21 strain.α-CGTase was expressed in fermentation culture medium and AA-2G was prepared by using α-CGTase, VC and starch.Resultsα-CGTase was expressed secretorily and the enzyme activity was up to 120 U/mL.AA-2G was prepared by the biotransformation of VC and starch using α-CGTase which proved to be correct by HPLC.ConclusionAA-2G was prepared by using self-made α-CGTase, after optimized the preparation conditions the yield of AA-2G was 17.46 g/L, and the conversion rate reached 58.2%(mg/mg).

α-CGTase;E.coli; Vitamin C; AA-2G; biotransformation

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.002

國家高技術研究發(fā)展(863)計劃(2014AA093603)；山東省科技發(fā)展計劃(2014GSF121043)；山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(2014CGZH1306)；山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF121003)；濟南市重大專項(201403009)

邢琳，女，主治醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：angela@126.com;劉飛，通信作者，男，助理研究員，研究方向：生物技術，E-mail：lfshwu@163.com。

Q786

A