李高青，桑青，崔凱

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000)

殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的抑菌性及細(xì)胞相容性研究

李高青，桑青Δ，崔凱

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252000)

目的 以實(shí)驗(yàn)室自制的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠為材料，探討其抑菌性及細(xì)胞相容性。方法 設(shè)置4組：A(含納米銀1×10-5的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠)，B(含納米銀5×10-6的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠)，C(含納米銀2×10-6的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠)，D(殼聚糖溫敏水凝膠，不含納米銀)。通過抑菌圈法測定4種樣品對6種革蘭陰性菌，1種革蘭陽性菌，3種真菌的抑菌作用；以SRB法測定其浸提液的細(xì)胞相容性。結(jié)果 隨著殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠中納米銀含量增加，抑菌作用增強(qiáng)，殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的抑菌作用優(yōu)于殼聚糖溫敏水凝膠；其浸提液無細(xì)胞毒性，具有良好的細(xì)胞相容性。結(jié)論 殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠有望作為新型創(chuàng)傷敷料。

殼聚糖；納米銀；溫敏水凝膠；抑菌性；細(xì)胞相容性

殼聚糖分子上有大量的羥基和氨基，易被化學(xué)修飾[1-4]，殼聚糖還能與金屬離子形成離子配合物[5-7]，可得到一系列的殼聚糖衍生物，使其具有更多的生物學(xué)功能，拓寬了應(yīng)用范圍，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用研究有了長足進(jìn)展。納米銀具有抗菌[8-10]、殺菌持久[11]、滲透性強(qiáng)、無耐藥性[12-13]等特點(diǎn)，近年來，在醫(yī)用材料的應(yīng)用中受到了廣泛的關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)制備殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠，探究其對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923等1種革蘭陽性菌，對大腸桿菌等6種革蘭陰性菌，對白色念珠菌等3種真菌的抑菌作用。并測定了其與NIH-3T3細(xì)胞的生物相容性，為殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料:殼聚糖(CS),批號20140318C(購于浙江金殼生物化學(xué)有限公司)、殼聚糖納米銀復(fù)合物(實(shí)驗(yàn)室自制)；硝酸銀、甘油磷酸鈉等均為國產(chǎn)分析純、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胰酶(美國Sigma公司)、磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)(美國Sigma公司)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國Falcon公司)、0.22 μL濾膜(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)、0.02 mm游標(biāo)卡尺(青島首豐精密機(jī)電有限公司)等。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基。

菌種：大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌的臨床菌株，白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌臨床菌株，以上均由聊城市中醫(yī)醫(yī)院提供。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，流感嗜血桿菌臨床菌株，以上均由聊城市人民醫(yī)院提供。

細(xì)胞：NIH-3T3細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

儀器:HH-8型恒溫水浴鍋(江蘇金壇新航儀器廠)；Heal Force CO2培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；TE2000S 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；WFZUV-2100型紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；MK3酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)等。

1.2 方法

1.2.1 溫敏水凝膠的制備:實(shí)驗(yàn)室自制得到含納米銀0.01%、0.025%、0.05%的殼聚糖納米銀復(fù)合物，稱取各樣品0.2 g溶解到10 mL 0.1 mol/L的冰乙酸溶液中，充分溶解后，逐滴加入56%的甘油磷酸鈉，滴加磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH值。取溶液2 mL至離心管中，放置于37 ℃恒溫水浴鍋中，相轉(zhuǎn)變后得水凝膠樣品：A(含納米銀1×10-5的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠)，B(含納米銀5×10-6的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠)，C(含納米銀2×10-6的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠)。同上操作制備不含納米銀的樣品D(殼聚糖溫敏水凝膠)。

1.2.2 各樣品對金黃色葡萄球菌(G+)臨床或標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用:將保存的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿上長出單菌落后，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌制備107cfu/mL的懸浮液。無菌條件下，在90 mm的培養(yǎng)皿中加適量的培養(yǎng)基，凝固后加100 μL菌液，涂布均勻，靜置20～30 min。將制備的各溫敏水凝膠樣品分別用打孔器做成直徑0.4 cm高0.2 cm的圓柱體，放置在固體培養(yǎng)基上，同一培養(yǎng)皿上依次放置樣品A、B、C、D，重復(fù)6次，細(xì)菌在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。觀察各樣品與培養(yǎng)基接觸面有無細(xì)菌生長，并用0.02 mm游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑大小。

金黃色葡萄球菌臨床菌株的抑菌作用操作同上。

1.2.3 各樣品對6種G-臨床或標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用:以大腸桿菌臨床菌株、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、銅綠假單胞菌臨床菌株、銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853、肺炎克雷伯菌臨床菌株、肺炎鏈球菌臨床菌株、陰溝腸桿菌臨床菌株及流感嗜血桿菌臨床菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，流感嗜血桿菌臨床菌株培養(yǎng)基為巧克力瓊脂培養(yǎng)基，其它菌種培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)方法同1.2.2。

1.2.4 各樣品對3種真菌的抑菌作用：以白色念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌為實(shí)驗(yàn)菌株，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，將保存的各菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)，分別配制菌液濃度為1×106cfu/mL的菌液，抑菌作用的測定方法操作同上，所用培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。

1.2.5 不同納米銀含量的溫敏水凝膠48 h浸提液的制備：各樣品水凝膠分別按照水凝膠樣品:細(xì)胞培養(yǎng)液=0.2 g:1 mL的比例浸泡，細(xì)胞培養(yǎng)液為添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃浸泡48 h得浸提液，0.22 μm濾膜過濾除菌，DMEM培養(yǎng)液依次稀釋，獲得稀釋0倍(C0)、5倍(C5)、10倍(C10)、20倍(C20)、50倍(C50)、100倍(C100)的水凝膠浸提液。

1.2.6 細(xì)胞存活率的測定：將對數(shù)生長期的NIH-3T3細(xì)胞按4000個(gè)/孔種植到96孔板，在37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長到80%以上，用不同稀釋倍數(shù)的浸提液處理。每組6個(gè)重復(fù)，以培養(yǎng)液培養(yǎng)為對照組，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，固定1 h，用SRB染色10 min，然后用乙酸沖洗，晾干，每孔加入100 μL Tris堿溶解，酶標(biāo)儀在492 nm處測吸光值。計(jì)算細(xì)胞的相對增殖率(relative growth rate，RGR)，RGR%=(處理組A值/對照組A值)×100%。

根據(jù)美國藥典中細(xì)胞毒性的六級標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)材料的毒性大小，細(xì)胞毒性反應(yīng)的分級如下：

表1 細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性分級的關(guān)系

毒性的判定標(biāo)準(zhǔn)：0級和Ⅰ級判為合格，Ⅱ級者結(jié)合形態(tài)分析綜合評價(jià)，Ⅲ～Ⅳ級者判為不合格。

2 結(jié)果

2.1 各樣品對金黃色葡萄球菌(G+)臨床或標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用 殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠對金黃色葡萄球菌臨床菌株及金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923的抑制作用結(jié)果見表2、圖1。各樣品對金黃色葡萄球菌均具有較好的接觸抑菌作用，各樣品與培養(yǎng)基接觸面均無細(xì)菌生長。從表2中可以看出，關(guān)于對金黃色葡萄球菌臨床菌株的抑菌作用，A樣品、B樣品、C樣品與D樣品相比抑菌圈直徑分別增加56%、30%、15%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用，A樣品、B樣品、C樣品與D樣品相比抑菌圈直徑分別增加51%、24%、14%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著納米銀含量增加，抑菌作用增強(qiáng)，殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的抑菌作用優(yōu)于殼聚糖溫敏水凝膠。

表2 各樣品對金黃色葡萄球菌(G+)臨床或標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑

**P<0.01，與D組比較，compared with group D

2.2 各樣品對6種G-臨床或標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用 殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠對6種G-臨床或標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用結(jié)果見表3、圖2。

*P<0.05，**P<0.01，與D組比較，compared with group D

圖2 各樣品對G-菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial activity of the samples on the gram-negative bacteria

殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠對6種革蘭陰性菌均具有較好的接觸抑菌作用，各樣品與培養(yǎng)基接觸面均無細(xì)菌生長。對6種革蘭陰性菌的抑菌作用中，C樣品對大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎鏈球菌臨床菌株、流感嗜血桿菌臨床菌株的抑菌圈直徑，與D組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，A、B樣品抑菌作用顯著強(qiáng)于D組(P<0.01)。殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的抑菌作用均優(yōu)于殼聚糖溫敏水凝膠。隨著納米銀含量增加，抑菌作用增強(qiáng)。各樣品對陰溝腸桿菌臨床菌株的抑菌圈直徑最大，抑菌作用最強(qiáng)，與其他組差異極顯著(P<0.05)。

2.3 各樣品對3種真菌的抑菌作用 各樣品對3種真菌：白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌的抑菌作用結(jié)果見表4、圖3。殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠對3種真菌均具有較好的接觸抑菌作用，各樣品與培養(yǎng)基的接觸面均無細(xì)菌生長。C樣品與D樣品對3種真菌的抑菌作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B樣品與D樣品比較，對光滑念珠菌抑菌作用差異為極顯著(P<0.01)，對其它2種真菌作用差異顯著(P<0.05)。A樣品與D樣品相比，對克柔念珠菌差異顯著(P<0.05)，對白色念珠菌和光滑念珠菌差異為極顯著(P<0.01)。隨著納米銀含量增加，抑菌圈直徑明顯增加，抑菌作用增強(qiáng)。殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的抑菌作用優(yōu)于殼聚糖溫敏水凝膠。對光滑念珠菌的的抑菌作用最強(qiáng)，對克柔念珠菌的抑菌作用明顯低于其余2種真菌。

樣品白色念珠菌臨床菌株光滑念珠菌臨床菌株克柔念珠菌臨床菌株A0.648±0.008**0.693±0.008**0.574±0.0058*B0.538±0.014*0.584±0.013**0.498±0.0161*C0.482±0.0070.493±0.0160.437±0.012D(對照)0.462±0.0110.478±0.0080.428±0.008

*P<0.05，**P<0.01，與D組比較，compared with group D

圖3 各樣品對真菌的抑菌作用Fig.3 Antibacterial activity of the samples on the fungi

2.4 細(xì)胞相容性 水凝膠浸提液對NIH-3T3細(xì)胞增殖的影響見表5。不同稀釋倍數(shù)的殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠浸提液刺激NIH-3T3細(xì)胞均沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。水凝膠浸提液稀釋10倍、20倍對NIH-3T3細(xì)胞的增殖有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。浸提液稀釋0倍、5倍，細(xì)胞的相對增殖率降低，但RGR均在75%以上。不同稀釋倍數(shù)的浸提液對NIH-3T3細(xì)胞的生長是有影響的，表現(xiàn)為較高濃度的浸提液培養(yǎng)細(xì)胞后，細(xì)胞的相對增殖率的降低，但這種情況還不構(gòu)成對NIH-3T3細(xì)胞的毒性作用。水凝膠浸提液對NIH-3T3細(xì)胞毒性符合生物材料的安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

表5 不同濃度的溫敏水凝膠浸提液毒性測試結(jié)果(n=6)

*P<0.05，**P<0.01，與D組比較，compared with group D

3 結(jié)論

殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，對大腸桿菌等6種革蘭染色陰性菌，對白色念珠菌等3種真菌均有較好的接觸抑菌作用，各樣品對陰溝腸桿菌臨床菌株的抑制作用最強(qiáng)，對克柔念珠菌抑制作用最弱，對細(xì)菌的抑菌作用優(yōu)于對真菌的抑菌作用。其與培養(yǎng)基的接觸面均無細(xì)菌生長；殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠的抑菌作用優(yōu)于殼聚糖溫敏水凝膠，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著納米銀含量的增加，抑菌作用增強(qiáng)，納米銀增強(qiáng)了殼聚糖溫敏水凝膠的抑菌作用。殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠具有廣譜抗菌性。殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠浸泡48h浸提液均沒有明顯的細(xì)胞毒性，有良好的細(xì)胞相容性。水凝膠浸提液稀釋10倍、20倍時(shí)能明顯的促進(jìn)NIH-3T3細(xì)胞的增殖。 殼聚糖納米銀復(fù)合物基溫敏水凝膠有較好的抑菌作用及有良好的生物相容性，作為新型創(chuàng)傷敷料有良好的研發(fā)應(yīng)用前景。

[1] Pei L,Cai Z,Shang S,et al.Synthesis and antibacterial activity of alkylated chitosan under basic ionic liquid conditions[J].J Appl Polym Sci, 2014,131(7): 2540.

[2] 任振俶.羧基化殼聚糖改性聚氨酯的制備和表征[D].大連：大連理工大學(xué),2012.

[3] 楊晉青.外加物理場對殼聚糖的醚化改性及其性能影響的研究[D].廣州：華南理工大學(xué),2010.

[4] Hu RX,Cheng JB,Bu DP,et al.Rare Earth-Chitosan Chelate:Functions and Applications in Animal Production[J].Chin J Anim Nutri,2013,25(8):1703-1707.

[5] 解勝利,茍建霞,丁宗旺.殼聚糖金屬鋅衍生物的制備及常溫櫻桃保鮮研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(14):3485-3488.

[6] Rahel J,Jonasova E,Nesvorna M,et al.The toxic effect of chitosan/metal-impregnated textile to synanthropic mites[J].Pest Manag Sci,2013,69(6):722-726.

[7] 楊金艷,蒲生彥,周艷,等.殼聚糖水凝膠制備及其對Pb2+吸附性能研究[J].環(huán)境工程, 2016, 34(1):16-20.

[8] 魏坤,吳遠(yuǎn),席云,等.復(fù)方納米銀抗菌乳液殺菌效果的研究[J].中國消毒學(xué)雜志,2010, 27(5):521-523.

[9] Gao J,Zhao C,Zhou J,et al.Plasma sprayed rutile titania-nanosilver antibacterial coatings[J].Appl Surf Sci,2015(355):593-601.

[10] Angela I,Amro E,Chitrada K,et al.Toxicity mechanisms in Escherichia coli vary for silver nanoparticles and differ from ionic silver[J].Acs Nano,2013,8(1): 374-386.

[11] 許聰.納米銀/脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備及抗菌性能評價(jià)[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué),2013.

[12] 李志軍,吳驍鋒,鄭凱,等.關(guān)于納米銀對耐藥菌抑制效果研究[J].廣州化工,2013, 41(12):102-104.

[13] Manish D, Seema B, Sharma VK,et al.Antibacterial Activity of Biologically Synthesized Nanosilver against Drug-Resistant Bacterial Pathogens[J].Int J Green Nanotech,2012,4(2):174-182.

(編校：王儼儼)

Antibacterial activity and cytocompatibility of chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel

LI Gao-qing, SANG QingΔ, CUI Kai

(School of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo explore the antibacterial activity and cytocompatibility of chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel.MethodsThere were 4 groups: group A (containing 1×10-5chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel), group B (containing 5×10-6chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel), group C (containing 2×10-6chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel), group D (chitosan thermosensitive hydrogel ).The antibacterial activity of the samples against six kinds of gram-negative bacteria, one kind of gram-positive bacterium, three kinds of fungi were measured by bacteriostatic circle.The cytocompatibility of the extraction to NIH-3T3 cells was studied by SRB.ResultsThe antibacterial activity enhanced with the increasing of nano silver concentration in chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel, whose antibacterial activity was better than chitosan thermosensitive hydrogel; its extraction has no cytotoxicity, thus showed good cytocompatibility.ConclusionThe chitosan-nano-silver complex thermosensitive hydrogel is a potential novel wound dressing.

chitosan; nano silver; thermosensitive hydrogel; antibacterial activity; cytocompatibility

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.16

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GGB01807)

李高青,女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物，E-mail：1291248398@qq.com；桑青，通信作者，女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物，E-mail：sangqing@lcu.edu.cn。

TB333;TB383

A