范方田，卞慶亞，吳紅雁Δ

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌對(duì)EGFR-TKI的獲得性耐藥研究

范方田1，卞慶亞2，吳紅雁2Δ

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

目的 探討告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼對(duì)肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor ，HGF)誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥的效應(yīng)及可能機(jī)制。方法 利用外源性HGF及與MRC-5共培養(yǎng)誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs耐藥模型；MTT法考察告達(dá)庭對(duì)HGF誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞耐吉非替尼的逆轉(zhuǎn)作用； Western blot檢測(cè)告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞耐藥的機(jī)制。結(jié)果 外源性HGF和MRC-5均可誘導(dǎo)PC-9對(duì)吉非替尼的耐藥作用，降低相對(duì)抑制率(P<0.05)；在HGF存在的情況下，單用告達(dá)庭(0～32 μM)和吉非替尼(1 μM)均不能顯著抑制PC-9的增殖，而告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼能劑量依賴性抑制PC-9增殖(P<0.05)。告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼下調(diào)Met及PI3K/AKT磷酸化水平(P<0.05)。結(jié)論 告達(dá)庭能逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥，其機(jī)制可能與其抑制Met/PI3K/AKT通路有關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞增殖；吉非替尼：告達(dá)庭

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)如吉非替尼和厄洛替尼，明顯改善了非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的生存率，尤其對(duì)于含有EGFR基因突變的腫瘤患者，可以從EGFR-TKIs治療中明顯獲益[1]。然而，幾乎所有對(duì)EGFR-TKIs初始治療敏感的EGFR基因突變的患者，經(jīng)過1年的治療后都不可避免地出現(xiàn)病情惡化，臨床上定義為EGFR-TKIs獲得性耐藥[2]。因此，迫切需要尋找新的治療策略來克服EGFR-TKIs獲得性耐藥。

告達(dá)庭(Gaudatin)是從傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥白首烏(耳葉牛皮消)中提取的一種C21甾體苷元，研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性；它能抑制肺癌A549細(xì)胞增殖并可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]；告達(dá)庭具有抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖的活性并且可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[4-5]。告達(dá)庭可增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡[6]。本研究通過探討吉非替尼聯(lián)合告達(dá)庭對(duì)體外誘導(dǎo)吉非替尼獲得性耐藥的NSCLC細(xì)胞PC-9的抗腫瘤效應(yīng)及其可能的機(jī)制，以期從天然產(chǎn)物中尋找能克服EGFR-TKIs獲得性耐藥的活性成分，為NSCLC的臨床聯(lián)合用藥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人肺癌PC-9細(xì)胞株及人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要藥物：告達(dá)庭購自南京森貝伽生物科技有限公司，吉非替尼由美國路易斯安那州立大學(xué)黃世樂實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，人重組肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)購自Peprotech公司，藥物用DMSO溶解配制成濃度為10 mmol/L的濃縮液，-20 ℃冰箱保存，臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)液配成所需濃度用于所有的實(shí)驗(yàn)中。

1.1.3 試劑：胎牛血清、DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Invitrogen公司，DMSO、MTT和碘化丙啶購自美國 Sigma公司，磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和 BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天公司，兔抗人磷酸化EGFR和EGFR、磷酸化MET和MET、磷酸化AKT和AKT、磷酸化PI3Kp85和PI3K p85多克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)用的化學(xué)發(fā)光劑購自美國 Millipore 公司。

1.1.4 儀器：超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司，型號(hào)：SW-CJ-ZFD)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo，型號(hào)：03793-6738)；倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss，型號(hào)：Discovery.V20)；超低溫冰箱(美國Nuaire，型號(hào)：Nu-6511)；酶標(biāo)儀(美國MD，型號(hào)：SPECTRA MAX 190)；電泳儀(美國Bio-Rad，型號(hào)：Mini Protean 3 Cell)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad，型號(hào)：GelDoc 2000) 0.22 μm濾膜(邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司)；

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和終質(zhì)量濃度為100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液或RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PC-9細(xì)胞(包括藥物處理組)與MRC-5成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)在直徑8 mm的Transwell小室(Corning)進(jìn)行，PC-9細(xì)胞(104個(gè)/孔)置于小室底部，MRC-5細(xì)胞置于小室上部，培養(yǎng)72 h后，小室上部細(xì)胞移去，小室底部的PC-9細(xì)胞用MTT檢測(cè)增殖情況。

1.2.2 MTT檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

① 外源性加入HGF：有報(bào)道外源性加入HGF可以誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥[7-8]，本實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的PC9細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×104個(gè)/mL，100 μL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，按組別分別給予藥物干預(yù)。分組如下：Caudatin；HGF+Caudatin；Caudatin+Gefitinib；HGF+Caudatin+Gefitinib；各組分別加入不同濃度的告達(dá)庭(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μM)，吉非替尼(1 μM)和HGF(20 ng/mL)的濃度固定，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液10 μL/孔(終質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入DMSO(150 μL/孔)，振蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)490 nm波長處各孔的吸光度(A)值，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率(%)=(A給藥孔/A對(duì)照孔)×100%，抑制率(%)=100%-相對(duì)存活率(%)。

② PC-9細(xì)胞與成纖維細(xì)胞MRC-5共培養(yǎng)：有報(bào)道成纖維細(xì)胞能產(chǎn)生HGF也可誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥[8]，本實(shí)驗(yàn)考察告達(dá)庭對(duì)PC-9細(xì)胞與MRC-5共培養(yǎng)后增殖的影響，共培養(yǎng)方法請(qǐng)見1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)部分，MTT方法同①。分組如下：Control、Gefitinib、Caudatin、Caudatin+Gefitinib。濃度：告達(dá)庭32 μM、吉非替尼1 μM。

1.2.3 Western blot檢測(cè)藥物處理后 PC9細(xì)胞中蛋白及磷酸化水平的表達(dá) Met及其下游的PI3K/AKT信號(hào)通路在HGF誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的耐藥中發(fā)揮重要作用[7,9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)藥物作用后對(duì)EGFR及Met相關(guān)信號(hào)通路蛋白的影響。取對(duì)數(shù)生長期的PC-9細(xì)胞，接種于100 mm2的培養(yǎng)皿中，1×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿；細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理。分組如下：Control、Caudatin、Gefitinib、Caudatin+Gefitinib；HGF、HGF+Caudatin、HGF+Gefitinib、HGF+Caudatin+ Gefitinib。濃度：告達(dá)庭32 μM、吉非替尼1 μM和HGF 20 ng/mL。收集藥物處理48 h后的PC-9細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，以含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg/孔蛋白在7.5%～12%SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉溶液于室溫下封閉反應(yīng)2 h，加入1:1000稀釋的一抗抗體及1:1000稀釋的GAPDH(內(nèi)參)抗體，4 ℃反應(yīng)過夜； TBST洗膜后，加入1:10000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔IgG二抗，室溫反應(yīng)2h；TBST洗膜3次后，置于Bio-Rad凝膠成像儀中，加入化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行化學(xué)顯色，分析蛋白條帶的位置及表達(dá)的情況，采用Photoshop 5.0軟件對(duì)蛋白條帶的灰度掃描后進(jìn)行半定量分析，結(jié)果采用與對(duì)應(yīng)內(nèi)參的相對(duì)比值。

2 結(jié)果

2.1 告達(dá)庭逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的耐藥 單獨(dú)加入告達(dá)庭(Control)在32 μM濃度范圍內(nèi)，對(duì)PC-9細(xì)胞增殖變化無顯著影響，在加入吉非替尼(1 μM)后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制(Control組vs.吉非替尼組，P<0.05)；在加入HGF (20 ng/mL)后，不加告達(dá)庭(0 μM)時(shí)，可見PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼(1 μM)產(chǎn)生耐藥，隨著告達(dá)庭濃度逐漸增加到32 μM時(shí)，細(xì)胞增殖抑制越來越明顯，在32 μM時(shí)的抑制率與不加HGF的Gefitinib組的相當(dāng)[Caudatin+Gefitinib組相對(duì)抑制率(67.13±0.72)%vs.Caudatin+Gefitinib+HGF組相對(duì)抑制率(69.24±1.95)%]。見圖1。

圖1 吉非替尼和告達(dá)庭對(duì)PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用±s)Fig.1 Effect of Caudatin and Gefitinib on proliferation of ±s)

2.2 告達(dá)庭逆轉(zhuǎn)與MRC-5共培養(yǎng)的PC-9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的耐藥 PC-9細(xì)胞與MRC-5細(xì)胞共培養(yǎng)后，對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥[與Medium相比，共培養(yǎng)體系中Gefitinib組對(duì)細(xì)胞的相對(duì)抑制率(7.03±0.81)%,遠(yuǎn)低于Medium對(duì)照體系中的相對(duì)抑制率(57.24±2.69)%，P<0.01]，但是Caudatin+Gefitinib組能明顯抑制細(xì)胞增殖[共培養(yǎng)體系中，Caudatin+Gefitinib組對(duì)細(xì)胞的相對(duì)抑制率(53.63±2.47)%vs.Gefitinib組的相對(duì)抑制率(7.03±0.81)%,P<0.01]，逆轉(zhuǎn)了MRC-5共培養(yǎng)后PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥。見圖2。

圖2 吉非替尼和告達(dá)庭與MRC-5共培養(yǎng)后的PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用NS: P>0.05,*P<0.05Fig.2 Effect of Caudatin and Gefitinib on proliferation ofNS: P>0.05,*P<0.05

2.3 告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼用藥對(duì)PC-9 細(xì)胞Met/PI3K/Akt通路的影響 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組藥物作用后對(duì)EGFR及Met相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。見圖3、表1。

圖3 吉非替尼和告達(dá)庭對(duì)PC-9細(xì)胞中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Caudatin and Gefitinib on expression of PI3K/Akt pathway in PC-9

GroupEGFRp-EGFRMetp-MetP13Kp-P13KAKTp-AKTControl1.32±0.121.03±0.461.30±0.940.35±0.150.91±0.830.31±1.070.84±0.380.57±0.43Caudatin1.25±0.361.08±0.471.28±0.190.01±0.01*0.85±0.060.23±0.490.78±0.520.56±0.34Gefitinib1.15±0.780.10±0.21*1.06±0.450.32±0.120.83±0.340.35±0.650.75±0.870.53±0.76Caudatin+Gefitinib1.20±0.290.22±0.37*1.01±0.130.05±0.36#0.87±0.920.21±0.570.81±0.140.02±0.02#HGF1.02±0.030.90±0.071.04±0.851.50±0.04*0.83±0.261.16±0.13*0.79±0.251.00±0.76*HGF+Caudatin1.16±0.431.27±0.821.15±0.860.01±0.01△0.84±0.230.21±0.64△0.80±0.710.52±0.91△HGF+Gefitinib1.01±0.080.24±0.09△1.23±0.741.05±0.17#0.88±1.010.28±0.26△0.71±0.070.51±0.39△HGF+Caudatin+Gefitinib1.10±0.840.27±0.061.03±0.900.02±0.01▲0.70±0.050.01±0.01▲0.61±0.090.01±0.01▲

*P<0.05，與Control組比較，compared with Control group;#P<0.05，與Gefitinib組比較，compared with Gefitinib group;△P<0.05，與HGF組比較，compared with HGF group;▲P<0.05，與HGF+Gefitinib組比較，compared with HGF+Gefitinib group

HGF誘導(dǎo)PC-9耐Gefitinib機(jī)制驗(yàn)證：與Control組比較，HGF組激活Met, P13K及AKT磷酸化(P<0.05)，與Gefitinib組比較，HGF+Gefitinib激活Met磷酸化(P<0.05)，這說明HGF能夠激活Met/PI3K/AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)Gefitinib耐藥。

Caudatin對(duì)Met/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響：基礎(chǔ)水平下，與Control組比較，Caudatin組顯著降低Met磷酸化(P<0.05)；與Gefitinib組比較，Caudatin+Gefitinib顯著降低p-Met和p-Akt的表達(dá)水平(P<0.05)。在HGF誘導(dǎo)的情況下，與HGF組比較，HGF+Caudatin組顯著降低p-Met、p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平(P<0.05)。這說明Caudatin 能抑制Met/PI3K/AKT信號(hào)通路。

Caudatin+Gefitinib對(duì)EGFR及Met相關(guān)信號(hào)通的影響：與HGF+Gefitinib組比較，HGF+Caudatin+ Gefitinib組顯著降低p-Met、p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平(P<0.05)。這提示Caudatin聯(lián)合Gefitinib能抑制Met信號(hào)通路。

綜上，提示告達(dá)庭可能通過抑制Met/PI3K/AKT通路發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥效應(yīng)。

3 討論

吉非替尼是被批準(zhǔn)的治療肺癌的二線化療EGFR-TKIs，主要用于己接受過以鉑類為基礎(chǔ)化療的進(jìn)展期NSCLC患者[11-12]。EGFR基因突變NSCLC患者對(duì)EGFR-TKIs的敏感性好，顯示出較好的療效[1,13]。然而，隨著治療時(shí)間的延長，初期對(duì)EGFR-TKIs治療敏感的EGFR基因突變患者1年后都不可避免地產(chǎn)生獲得性耐藥。

通過對(duì)臨床病例的分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥的有61%患者都出現(xiàn)HGF高表達(dá)、T790M突變和Met擴(kuò)增，其中HGF是一種多功能的細(xì)胞因子，不僅會(huì)來自腫瘤細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞液也會(huì)產(chǎn)生。HGF與其受體Met結(jié)合后與EGFR信號(hào)通路產(chǎn)生交互作用[14]。研究表明，HGF以劑量依賴性的方式使NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs產(chǎn)生獲得性耐藥，主要是因?yàn)樗ㄟ^Met途徑激活了PI3K/AKT通路[7]，因此，要克服HGF誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的獲得性耐藥，就需要同時(shí)阻斷EGFR 和 HGF-Met信號(hào)通路，于是，尋找合適的化合物與EGFR-TKIs聯(lián)用來克服NSCLC獲得性耐藥是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

從天然產(chǎn)物中尋找活性成分聯(lián)合化療可以增效減毒，目前已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中顯示出顯著的療效[15]，告達(dá)庭是中藥白首烏(耳葉牛皮消)中的一種C21甾體苷元，研究發(fā)現(xiàn)它具有較好的抗腫瘤活性，但目前對(duì)于其具體作用機(jī)制不是十分明確，本研究結(jié)果顯示，告達(dá)庭聯(lián)合吉非替尼對(duì)外源性HGF誘導(dǎo)的PC-9獲得性耐藥有較好的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，聯(lián)合用藥組抗增殖作用明顯強(qiáng)于各單藥組。通過初步對(duì)其機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，告達(dá)庭能通過抑制Met/PI3K/Akt通路從而恢復(fù)NSCLC細(xì)胞PC-9對(duì)吉非替尼的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，告達(dá)庭對(duì)EGFR磷酸化水平無明顯影響，但是能抑制Met和 PI3k/Akt磷酸化水平；告達(dá)庭與吉非替尼聯(lián)合用藥能同時(shí)顯著抑制EGFR、HGF-Met 信號(hào)通路，提示告達(dá)庭可能通過抑制Met/PI3K/AKT通路發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥效應(yīng)。但告達(dá)庭這種逆轉(zhuǎn)耐藥的效應(yīng)還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和大量的臨床研究進(jìn)一步予以證實(shí)。

總而言之，本研究結(jié)果表明，告達(dá)庭在體外能逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥，對(duì)Met/PI3K/Akt信號(hào)通路有顯著抑制，因此告達(dá)庭可能會(huì)成為有潛力的能克服NSCLC對(duì)EGFR-TKIs獲得性耐藥的一種化合物，也符合從天然產(chǎn)物中尋找活性成分聯(lián)合現(xiàn)有靶向藥物發(fā)揮多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

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(編校：王儼儼)

Caudatin combined with Gefitinib reversing HGF induced non-small cell lung cancer to EGFR-TKI acquired drug resistance

FAN Fang-tian1, BIAN Qing-ya2, WU Hong-yan2Δ

(1.Department of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine Hanlin College, Taizhou 225300, China; 2.Department of Pharmacy,Yancheng Health Vocational and Technical College, Yancheng 224005, China)

ObjectiveTo investigate the effect and underlying mechanism of Caudatin combined with Gefitinib on Gefitinib resistance induced by HGF in PC-9.MethodsModel of EGFR-TKIs resistance in PC-9 cells was induced by exogenous HGF and co-cultured with MRC-5.Caudatin was tested as a drug resistant modulator to reverse the resistance of Gefitinib in PC-9 cells induced by HGF by MTT assay.Western blot was performed to observe the mechanism of Caudatin combined with Gefitinib reversing the resistance of PC-9 induced by HGF.ResultsThe resistance of gefitinib to PC-9 was induced by exogenous HGF and co-cultured with MRC-5 which could reduce relative inhibitory rate (P< 0.05).Neither caudatin (0-32 μM) or Gefitinib (1 μM) alone could significantly inhibit proliferation of PC-9 in the presence of HGF, which could be inhibited in a dose-dependent manner by Caudatin combined with Gefitinib (P<0.05); Caudatin combined with Gefitinib down-regulated the phosphorylation levels of Met and PI3K/Akt simultaneously (P< 0.05).ConclusionCaudatin could reverse the drug resistance of Gefitinib in PC-9 induced by HGF, the mechanism of which may be related to the inhibition of Met/PI3K/AKT pathway.

non-small cell lung cancer; cell proliferation; Gefitinib; Caudatin

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.14

鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃(YK2014062)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目

范方田，男，碩士，講師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理，E-mail：fftian3912@163.com；吳紅雁，通信作者，男，碩士，講師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理，E-mail：why20133055@163.com。

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