王，齊心潔，郭紅霞，劉，胡賢達(dá)，黃迎春Δ

(1.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室，北京 100023；3.中國藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院，北京 100029)

原癌蛋白MDM2分離純化及結(jié)晶條件的初步篩選

(1.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室，北京 100023；3.中國藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院，北京 100029)

目的 探討原癌蛋白MDM2分離純化的條件，獲得高純度的目的蛋白，篩選該蛋白的結(jié)晶條件，獲得MDM2蛋白結(jié)晶。方法 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)MDM2蛋白，采用Ni-NTA親和柱和分子篩對該蛋白進行分離純化，通過圓二色光譜法對其二級結(jié)構(gòu)進行分析，采用坐滴法對結(jié)晶條件進行初步的篩選。結(jié)果 獲得了高純度的MDM2蛋白，其二級結(jié)構(gòu)有序，在低pH條件下有形成晶體結(jié)構(gòu)的傾向。結(jié)論 MDM2蛋白結(jié)晶的最適pH為5.5，最適的MDM2蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL。

MDM2；原核表達(dá)；分離純化；結(jié)晶

抑癌基因的失活和原癌基因的異常激活通常會導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。鼠雙微基因 (Murine double minute 2，MDM2)基因是一個原癌基因，也是腫瘤抑制基因p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的調(diào)節(jié)因子。其編碼一個由491個氨基酸殘基所組成的鋅指蛋白[1]，能夠作為E3泛素連接酶介導(dǎo)p53的降解[2]。此外，MDM2能夠結(jié)合并掩蓋p53的反式激活結(jié)構(gòu)域，從而抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性[3]。MDM2在體內(nèi)與p53構(gòu)成反饋體系，并與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一起形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控、生長抑制、凋亡等過程[4]。MDM2的過量表達(dá)，與乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、人喉鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、脂肪肉瘤、食道癌、骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4]。

MDM2涉及的生理活性十分復(fù)雜，其相關(guān)信號通路并不明確，設(shè)計MDM2 抑制劑需要獲得更加準(zhǔn)確的MDM2蛋白結(jié)構(gòu)與功能，其前提條件是需要得到高質(zhì)量的MDM2蛋白結(jié)晶[5]。本實驗室前期已對MDM2蛋白的表達(dá)條件進行了優(yōu)化，本文旨在采用Ni-NTA親和柱和分子篩對該蛋白進行分離純化，并采用圓二色光譜分析及初步晶體學(xué)研究，為MDM2蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒：含重組質(zhì)粒pET28a-MDM2的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 藥品和試劑：蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxoid公司；IPTG和溶菌酶購自美國Merck公司；卡那霉素、Tris-HCl、四甲基乙二胺及十二烷基硫酸鈉購自美國Amresco公司；β-巰基乙醇和磷酸鹽緩沖液購自美國Invitrogen公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大MBI Fermentas公司；蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒分別購自北京博亞捷晶科技有限公司和美國Hampton公司，其他試劑購自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器：搖床購自上海和呈儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱購自上海一恒儀器設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機購自美國Thermo Fisher公司；超聲波細(xì)胞破碎儀購自中國新芝公司；凝膠電泳系統(tǒng)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FPLC系統(tǒng)購自美國GE公司；HPLC及檢測系統(tǒng)購自美國Agilent公司；光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET28a-MDM2的原核表達(dá):取2 μL重組質(zhì)粒pET28a-MDM2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將長出的單菌落，接種至含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時，加入IPTG (終濃度0.2 mmol/L)進行誘導(dǎo)表達(dá)，15 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)20 h。用1 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.0)漂洗菌體3次，加入溶菌酶溶液(pH 8.0 Tris-HCl 50 mmol/L，溶菌酶10 mg/mL)至終濃度100 μg/mL。室溫放置15 min后，在冰浴條件下進行超聲裂解操作。12000 r/min離心，分別收集上清液及細(xì)胞碎片沉淀，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.2 MDM2蛋白的分離純化:將收集的細(xì)胞先用Buffer A(20 mmol/L Tris，0.3 mol/L NaCl，pH8.0)漂洗2次，每克濕菌體加3 mL Buffer A重懸，再加入上述溶菌酶溶液至終濃度100 μg/mL，室溫放置10 min后在冰浴中進行超聲破碎，功率設(shè)置為300 w，每次超聲5 s，停7 s，重復(fù)50。20000 r/min下離心1 h，收集上清。將超聲波破碎的上清全部緩慢通過Ni柱，再將Ni柱轉(zhuǎn)移至FPLC儀器上分析，用Buffer B (20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脫收峰，SDS-PAGE電泳分析。將收集目的蛋白通過分子篩凝膠過濾層析進行進一步分離純化，使用GE公司Superdex 200 10/300凝膠過濾預(yù)裝柱，通過Buffer C(200 mmol/L乙酸，200 mmol/L KCl，5 mmol/L β-巰基乙醇，pH 4.5)洗脫，收集目標(biāo)蛋白并進行濃縮。

1.2.3 MDM2蛋白二級結(jié)構(gòu)的圓二色譜測定:將經(jīng)純化的目的蛋白稀釋至0.5 mg/mL，通過日本分光株式會社Jasco J-810圓二色光譜儀進行圓二色譜(circular dichroism，CD)掃描。掃描區(qū)域為遠(yuǎn)紫外190～240 nm，樣品池光程為0.5 mm。CD譜測定在北京大學(xué)蛋白質(zhì)和基因工程國家重點實驗室完成。

1.2.4 MDM2蛋白結(jié)晶條件初篩:將純化后的目的蛋白用截留相對分子質(zhì)量為10000的超濾濃縮管濃縮，利用蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒BCR 1-96、Index 1-96、Kit I 1-48、Kit II 1-48、Natrix 1-48、Wizard I 1-48、Wizard II 1-48、Wizard III 1-48共計480個條件，通過坐滴氣相擴散法進行篩選。將蛋白溶液與池液在晶體板的樣品槽內(nèi)等比例混合，用透明膠條密封，置于16 ℃恒溫室中，每5天通過顯微鏡觀察蛋白液滴內(nèi)晶體的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 MDM2的原核表達(dá) 和未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞相比，經(jīng)重組質(zhì)粒pET28a-MDM2轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞在大約23 kDa處有明顯的新增條帶，與預(yù)測分子質(zhì)量相符，說明目的蛋白MDM2在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。通過收集菌體并經(jīng)超聲破碎離心后的上清液與沉淀相比較，目的蛋白大量存在于上清液中，說明目的蛋白為可溶性表達(dá)。見圖1。

圖1 MDM2蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析1: 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(M)； 2: 未誘導(dǎo)的全細(xì)胞；3: 未經(jīng)破碎的全細(xì)胞；4，5: 細(xì)胞破碎離心后的上清液；6，7: 細(xì)胞破碎離心后的沉淀Fig.1 SDS-PAGE analysis of MDM2 protein expression in E.coli1: Standard protein (M); 2: Non-induced by whole cell; 3: Non-broken whole cell; 4, 5: Supernatant after centrifugation; 6, 7: Precipitation after centrifugation

2.2 MDM2蛋白的分離純化 親和層析純化圖譜顯示，沒有明顯的單峰出現(xiàn)，見圖2A。進一步采用SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)洗脫出來的蛋白雖然主要是目的蛋白，但是有較多的雜蛋白，見圖2B。將濃縮得到的蛋白質(zhì)通過Superdex 200進行凝膠柱層析分離，得到圖2C所示圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白洗脫峰不夠規(guī)則，可能是蛋白純度較低，也可能是蛋白質(zhì)有聚集。

該蛋白是一個結(jié)合鋅離子的酸性蛋白，因此優(yōu)化分離純化的條件為在Buffer A、B、C中分別添加了50 μmol/L ZnSO4，進一步降低分子篩洗脫液Buffer C的pH值至3.5(200 mmol/L 乙酸，200 mmol/L KCl，50 μmol/L ZnSO4，5 mmol/L β-ME，pH 3.5)。經(jīng)Ni-NTA洗脫后得到了一個單峰(圖2D)，收峰后通過高效液相色譜儀檢測顯示，經(jīng)優(yōu)化后的蛋白分離純化方案所得到的目的蛋白純度較高，幾乎沒有雜蛋白存在(圖2E)。

圖2 MDM2蛋白的分離純化A：未經(jīng)優(yōu)化的MDM2蛋白Ni-NTA親和層析圖譜；B：未經(jīng)優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖；C：未優(yōu)化的MDM2蛋白粗提物分子篩圖譜；D：優(yōu)化的MDM2蛋白Ni-NTA親和層析圖譜；E：優(yōu)化的MDM2蛋白分子篩圖譜Fig.2 Purification of MDM2 proteinA: Ni-NTA affinity chromatogram of MDM2 protein without optimization; B: SDS-PAGE electrophoresis without optimization; C: molecular sieve map of MDM2 protein crude extract without optimization; D: Ni-NTA affinity chromatogram of MDM2 protein with optimization; E: molecular sieve map of MDM2 protein with optimization

2.3 CD分析MDM2蛋白的二級結(jié)構(gòu) Jasco J-810圓二色譜儀掃描顯示，MDM2蛋白在遠(yuǎn)紫外200 nm處有明顯單負(fù)峰，顯示出明顯的β-片層結(jié)構(gòu)的圓二色譜特征吸收。見圖3。在得到的MDM2蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占20%以上，β-折疊占50%左右，其余大約30%為無規(guī)律卷曲。提示MDM2蛋白在水溶液中主要以β-片層的結(jié)構(gòu)存在。

圖3 MDM2蛋白的圓二色譜圖Fig.3 Circular two chromatogram of MDM2 protein

圖4 MDM2蛋白結(jié)晶條件的初篩A：澄清蛋白液滴；B：蠟狀起泡沉淀；C：球狀油滴；D：凝膠狀蛋白液滴；E：變性蛋白沉淀；F：顆粒狀沉淀Fig.4 Initial screening of crystallization conditions of MDM2 proteinA: Clear protein droplets; B: Waxy foam precipitation; C:Globular oil droplets; D: Gel like protein droplets; E: Denaturing protein precipitation; F: Granular precipitation

2.4 結(jié)晶條件的初步篩選 通過蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒BCR 1-96、Index 1-96、Kit I 1-48、Kit II 1-48、Natrix 1-48、Wizard I 1-48、Wizard II 1-48、Wizard III 1-48對 MDM2蛋白進行了結(jié)晶條件的初步篩選，見圖4。所得結(jié)果大致可以分為6類：澄清蛋白液滴(Index 17，pH 5.6，1.26 mol/L NaPO4·H2O，0.14 mol/L K2HPO4)；蠟狀起泡沉淀(Wizard III 18，20%(w/v) PEG 6000，100 mmol/L 檸檬酸/ NaOH pH 4.0，1000 mmol/L LiCl)；球狀油滴(Kit I 48，0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.5，2.0 mol/L 磷酸氫銨)；凝膠狀蛋白液滴(Index 46，0.1 mol/L Bis-Tris pH 6.5，20%w/v MPEG5000)；變性蛋白沉淀(Kit II 30，0.1 mol/L HEPES pH 7.5，10%w/v PEG 6000，5%v/v (+ / -)-2-甲基-2,4-戊二醇)；顆粒狀沉淀(Index 7, 0.1 mol/L檸檬酸 pH 3.5，3.0 mol/L NaCl)。其中呈現(xiàn)A-C的條件，提示蛋白質(zhì)在這些條件下處于溶解狀態(tài)；呈現(xiàn)D-E的條件，提示蛋白質(zhì)在這些條件下處于變性狀態(tài)；而其中呈現(xiàn)顆粒狀沉淀的條件，則提示有希望進一步優(yōu)化獲得可衍射的晶體。

3 結(jié)論

獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶的首要步驟，是通過高效的蛋白質(zhì)表達(dá)與分離純化獲得高純度的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的純度高與否決定了蛋白質(zhì)能否長出晶體，也是蛋白質(zhì)結(jié)晶中最關(guān)鍵的因素。本文在大腸桿菌中高效表達(dá)了人MDM2蛋白，并通過增加硫酸鋅和降低pH的方法使MDM2蛋白成功純化。在Buffer A(20 mmol/L Tris，0.3 mol/L NaCl，50 μmol/L ZnSO4，pH 8.0)、Buffer B(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，50 μmol/L ZnSO4，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)、Buffer C(200 mmol/L 乙酸，200 mmol/L KCl，50 μmol/L ZnSO4，5 mmol/L β-巰基乙醇，pH 3.5)的條件下分離純化MDM2蛋白，實驗方法相對簡單，穩(wěn)定性較好，得到的MDM2蛋白純度較高，符合結(jié)晶要求。

然而，蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的初步篩選并無規(guī)律可循。通常需要通過蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒進行高通量的篩選[6]。本文采用了不同公司生產(chǎn)的8個試劑盒，共計480個條件，對MDM2蛋白的結(jié)晶條件進行了初篩。然而，在已采用的各種不同的結(jié)晶培養(yǎng)條件下，目前均未獲得MDM2蛋白結(jié)晶。蛋白結(jié)晶的前體條件是純度高于95%且均一度較高[7]，雖然已獲得的蛋白純度較高，且圓二色譜分析顯示其二級結(jié)構(gòu)有序(圖3)，然而先前的凝膠柱層析顯示洗脫峰較為雜亂(圖2C)，提示有可能存在蛋白聚集等影響蛋白均一度的情況，這可能是導(dǎo)致無法結(jié)晶的原因之一。但本文中所示呈現(xiàn)顆粒狀沉淀的條件(圖4)，則提示有希望能夠通過進一步優(yōu)化，最終獲得可衍射的晶體。因此在初步篩選到有利于結(jié)晶形成的條件的基礎(chǔ)上，即MDM2蛋白結(jié)晶時使用的溶液的pH值應(yīng)選擇5.5、MDM2蛋白結(jié)晶較適宜的濃度為10 mg/mL，可以進一步優(yōu)化結(jié)晶條件，從而得到MDM2蛋白結(jié)晶。

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(編校：吳茜)

Purification and optimization of crystallization conditions of oncogenic protein MDM2

WANG Yue1,2, QI Xin-jie1,2, GUO Hong-xia1,2, LIU Yue1,2, HU Xian-da3, HUANG Ying-chun1,2Δ

(1.Biochemical Engineering College, Beijing Union University, Beijing 100023, China; 2.Beijing Key Laboratory of Biomass Waste Resource Utilization, Beijing 100023, China; 3.Beijing Tibetan Hospital,China Tibetology Research Center, Beijing 100029, China)

ObjectiveTo investigate and optimize the condition of purification and crystallization of oncogenic protein MDM2.MethodsMDM2 was expressed inE.coliexpression system, and purified by Ni-NTA chelating affinity chromatography and molecular sieve chromatography.The secondary structure of purified protein was analyzed by circular dichroism spectroscopy (CD).Then the crystallization condition of MDM2 was screened and optimized by sitting-drop vapor-diffusion method.ResultsHigh purity of MDM2 was obtained by Ni-NTA chelating affinity chromatography and molecular sieve chromatography purification.CD analysis indicated the secondary structure of MDM2 was ordered.Protein-crystallisation experiments illustrated that MDM2 was prone to crystallization under lower pH.ConclusionThe optimum pH of MDM2 protein crystallization is 5.5, the optimum protein concentration is 10 mg/mL.

MDM2; prokaryotic expression; purification; crystallization

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.10

王玥，女，實驗師，研究方向：生物化學(xué)，E-mail:13581978641@139.com；黃迎春，通信作者，女，教授，研究方向：遺傳學(xué)，E-mail:hyc@buu.edu.cn。

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