何帥，尹力，鐘偉，邱志兵Δ

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 心胸血管外科，江蘇 南京 210006；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌中心，福建 廈門 361102)

慢病毒介導(dǎo)siRNA靶向下調(diào)USP39表達(dá)對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的影響

何帥1，尹力1，鐘偉2，邱志兵1Δ

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 心胸血管外科，江蘇 南京 210006；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌中心，福建 廈門 361102)

目的 探討慢病毒介導(dǎo)siRNA靶向下調(diào)泛素化特異性蛋白酶USP39對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖及遷移能力的影響。方法 設(shè)計(jì)合成5組siRNA：對(duì)照組(siControl)、siRNAUSP39-70、siRNAUSP39-71、siRNAUSP39-72、siRNAUSP39-73，用慢病毒介導(dǎo)siRNA，轉(zhuǎn)染小鼠血管平滑肌細(xì)胞VSMC，并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。Western blot檢測各組干擾效率，挑選出干擾效率最高的siRNA。細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果 成功建立了穩(wěn)定下調(diào)USP39的小鼠血管平滑肌細(xì)胞VSMC(siRNAUSP39-73組)。與轉(zhuǎn)染空載的VSMC(siControl組)及空白對(duì)照VSMC(Normal組)比較，siRNAUSP39-73組USP39蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖及遷移能力均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 靶向下調(diào)USP39蛋白能抑制血管平滑肌細(xì)胞VSMC的增殖及遷移能力。

慢病毒；USP39；血管平滑肌細(xì)胞；增殖；遷移

冠心病患者行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后面臨血管的再狹窄，降低了手術(shù)遠(yuǎn)期效果。研究認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，中膜平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚引起的內(nèi)膜增厚和血管重構(gòu)是移植血管發(fā)生再狹窄的主要原因。減少血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖是降低移植血管再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵之一，但其機(jī)制尚不清楚，治療手段也十分有限。去泛素化酶蛋白酶USP39是分子量65 kDa的U4/U6.U5三聚小核糖核蛋白體的剪接因子相關(guān)蛋白[1]。目前有限的針對(duì)USP39的研究顯示USP39主要有以下功能：RNA的剪切[2-4]、維持紡錘體監(jiān)測點(diǎn)的功能[5]、調(diào)節(jié)其他去泛素化酶的活性[6]、調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。本研究組前期通過建立小鼠頸動(dòng)脈狹窄模型和豬大隱靜脈-頸動(dòng)脈移植模型，證實(shí)了USP39蛋白在血管再狹窄模型中高表達(dá)(正在投稿中)。表明血管再狹窄可能與USP39的高表達(dá)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移有關(guān)。本研究擬用慢病毒介導(dǎo)的siRNA干擾技術(shù)靶向下調(diào)USP39表達(dá)，觀察其對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，探討USP39在血管再狹窄中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠血管平滑肌細(xì)胞VSMC購自南京沐塞生物科技有限公司；293T細(xì)胞由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌中心實(shí)驗(yàn)室提供；siRNAUSP39-70、71、72、73質(zhì)粒均購自上海吉?jiǎng)P基因，BCA蛋白濃度測量試劑盒，轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、USP39抗體、二抗均購自美國Abcam公司，DMEM、opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素均購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠血管平滑肌細(xì)胞VSMC與293T細(xì)胞使用DMEM(含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定下調(diào)USP39表達(dá)的小鼠VSMC的建立：設(shè)計(jì)并合成4組siRNAUSP39-70、71、72、73質(zhì)粒(siRNAUSP39-70：GAATAACATAAAGGCCAAT；siRNAUSP39-71：CGGGTATTGTGGGACTGAA；siRNAUSP39-72：TTCCAGACAACT-ATGAGAT；siRNAUSP39-73：TTTGGAAGAGGCGAGATAA)，和siControl一起分成5組，從中篩選出敲低USP39表達(dá)效果最明顯的質(zhì)粒組。293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，長至60%密度時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑由Lipo2000脂質(zhì)體(2.5 μL/μg質(zhì)粒)+1.5 μg包裝質(zhì)粒+1.5 μg病毒載體+200 μL opti-MEM組成，轉(zhuǎn)染12 h后換新鮮培養(yǎng)基，36 h后收取病毒液感染小鼠VSMC，并用polybrene增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率，用嘌呤霉素(1 μg/mL)篩選2 w后，獲得穩(wěn)定干擾USP39表達(dá)的小鼠VSMC細(xì)胞。

1.2.3 Western blot對(duì)感染效率的鑒定：將感染48 h后的各組細(xì)胞(siControl、siRNAUSP39-70、71、72、73)胰酶消化后提取蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，USP39一抗(1:1000稀釋)4 ℃過夜，洗膜后二抗(1:100000稀釋)孵育1 h，洗膜后顯影，曝光。重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Western blot結(jié)果選擇穩(wěn)定下調(diào)USP39的VSMC系，為siRNAUSP組，同時(shí)設(shè)定siControl組及Normal組，將VSMC以1×104個(gè)細(xì)胞密度接種24孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)加入各組siRNAs之后培養(yǎng)72 h，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器分別計(jì)數(shù)各孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量。重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長期siControl組和siRNAUSP組VSMC。Transwell小室上室加入混有5 000個(gè)細(xì)胞的200 μL無血清細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，取出小室，吸出培養(yǎng)基，PBS清洗3次，擦去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，無水甲醇固定，晾干，結(jié)晶紫室溫染色，PBS清洗3次，顯微鏡下每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿過膜的細(xì)胞數(shù)并拍照，取平均值。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)的siRNAUSP39-73靶向干擾小鼠VSMC表達(dá)USP39蛋白 Western blot結(jié)果顯示，siRNAUSP39-73組細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平顯著低于siControl組及其余siRNA組(P<0.05)，表明siRNAUSP39-73能靶向下調(diào)小鼠VSMC細(xì)胞的USP39的表達(dá)，且下調(diào)效果最好。見圖1。

圖1 各siRNAs組細(xì)胞USP39蛋白表達(dá)比較(n=3)**P<0.01,與siControl相比Fig.1 Comparison of USP protein levels among each group(n=3)**P<0.01,compared with siControl

2.2 USP39對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染siRNAs 72 h后，VSMC細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，siRNAusp39-73組細(xì)胞個(gè)數(shù)為34866±5201，顯著低于正常對(duì)照組(47783±1818)和siControl組(47700±3488，P<0.05)。表明下調(diào)USP39的表達(dá)可以抑制siControl細(xì)胞的增殖能力。見圖2。

圖2 各siRNAs組VSMC細(xì)胞增殖能力比較(n=3)*P<0.05Fig.2 Comparison of VSMC cell proliferation ability among each group(n=3)*P<0.05

2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測小鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移能力 與Normal空白對(duì)照組和siControl組相比，siRNAUSP39-73組細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(P<0.001)，但Normal組與siControl組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 各siRNAs組VSMC細(xì)胞遷移能力比較(n=3，×40)***P<0.001Fig.3 Comparison of VSMC cell migration ability among each group(n=3,×40)***P<0.001

3 討論

血管再狹窄可能與炎癥反應(yīng)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的大量聚積有關(guān)。有效抑制炎癥反應(yīng)，減少血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖是降低移植血管再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵。血管平滑肌細(xì)胞在血管再狹窄形成中的作用一直備受關(guān)注。在靜脈橋血管壁上多種細(xì)胞因子的表達(dá)包括ET-I、血小板獲得性生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，基質(zhì)蛋白的分解，都可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。在其他已有的研究中也發(fā)現(xiàn)多種蛋白及基因與血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移有關(guān)，如骨橋蛋白o(hù)steopontin[10]、periostin[11]、connexin 34[12]、microRNA-21基因[13]等，但關(guān)于USP39與血管平滑肌細(xì)胞之間的關(guān)系尚未有研究。

本課題組先前研究結(jié)果表明USP39蛋白在血管再狹窄模型中高表達(dá)，因此推測USP39極可能是與血管狹窄緊密相關(guān)的分子。USP39雖是泛素特異性蛋白酶家族的一員，但因?yàn)樗鄙倩钚源呋稽c(diǎn)必要的氨基酸：半胱氨酸和組氨酸，導(dǎo)致其沒有去泛素化酶活性。已有文獻(xiàn)報(bào)道USP39在調(diào)控mRNA水平上起到重要作用，并在細(xì)胞有絲分裂過程中扮演重要角色[1]。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)USP39的表達(dá)能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。Wen等[8]發(fā)現(xiàn)去SUMO化的USP39蛋白能顯著增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力。

本研究采用慢病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)靶向下調(diào)VSMC細(xì)胞的USP39表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示該慢病毒載體系統(tǒng)可高效、穩(wěn)定地感染小鼠血管平滑肌細(xì)胞。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)證明siRNAUSP39-73組細(xì)胞的增殖能力較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNAUSP39-73組細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。

綜上所述，通過慢病毒介導(dǎo)的沉默USP39的表達(dá)能夠顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移。USP39可能對(duì)血管成形術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生及發(fā)展起到重要作用。下一步將對(duì)USP39影響血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移的調(diào)控機(jī)制及分子基礎(chǔ)進(jìn)行研究，以期為血管再狹窄的分子靶向治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

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(編校：吳茜)

Effects of lentivirus-mediated siRNA interference of USP39 on proliferation and migration of mice vascular smooth muscle cell

HE Shuai1, YIN Li1, ZHONG Wei2, QIU Zhi-bing1Δ

(1.Department of Cardiothoracic and Vascular Surgery, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China;2.Cancer Research Center, Medical College of Xiamen University, Xiamen 361102, China)

ObjectiveTo investigate the effect of lentivirus-mediated siRNA interference of USP39 on proliferation and migration of mice vascular smooth muscle cell in vitro.MethodsFive siRNAs of siControl, siRNAUSP39-70, siRNAUSP39-71, siRNAUSP39-72 and siRNAUSP39-73 were designed and sythezied，mice VSMCs were infected with the lentivirus for delivering siRNAUSP39-73, and the stably transfected cells were selected by puromycin.The interference efficiency of siRNAUSP39-73 was assessed with Western blot.The effect of USP39 interference on the proliferation of VSMCs was determined by cells counting and MTT assay.Transwell assay was used to detect the migration of VSMCs.ResultsRecombinant lentiviral vector siRNAUSP39-73 was successfully transfected into mice VSMCs.Comparing with siControl group and Normal group, USP39 protein level of siRNAUSP39-73 VSMCs were decreased(P<0.05), and the proliferation and migration ability were all inhibited(P<0.05).ConclusionTargeted down-regulation of USP39 expression can inhibit the proliferation and migration of mice VSMCs in vitro.

lentivirus; USP39; VSMC; proliferation; migration

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.09

江蘇省“六大人才高峰”B類(2014-WSW-052)

何帥，男，碩士在讀；研究方向：血管成形術(shù)后血管再狹窄的治療，E-mail：m15195851990_1@163.com；邱志兵，通信作者，男，博士，副主任醫(yī)師、副教授，研究方向：血管成形術(shù)后血管再狹窄的治療，左心輔助對(duì)終末期心衰的治療，E-mail：qiuzhibing2009@163.com。

Q291

A