王春梅，盧麗君，林振宇

(1.龍巖學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建龍巖364000; 2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建福州350116)

基于點(diǎn)擊化學(xué)的炔雌醇熒光傳感器

王春梅1，盧麗君2，林振宇2

(1.龍巖學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，福建龍巖364000; 2.福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建福州350116)

炔雌醇是一種環(huán)境干擾物，高濃度的炔雌醇會(huì)對(duì)環(huán)境、生物等造成一定的傷害.根據(jù)Cu(I)可以催化炔雌醇與帶疊氮基團(tuán)的疊氮香豆素之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)(CuAAC反應(yīng))，生成具有1，2，3–三唑五元環(huán)的大分子結(jié)構(gòu)化合物.由于整個(gè)分子中共軛結(jié)構(gòu)的增加，使得反應(yīng)后體系的熒光信號(hào)增強(qiáng).通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)前后熒光信號(hào)的變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)炔雌醇的高靈敏檢測(cè).在最佳條件下，傳感器的相對(duì)熒光強(qiáng)度與炔雌醇的質(zhì)量濃度在0.1～2.5 μg·L－1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.05 μg·L－1.

炔雌醇;疊氮香豆素;Cu(I);熒光傳感器

0 引言

炔雌醇是重要的人工合成雌激素，屬于甾類(lèi)同化激素中的一種［1］.炔雌醇常用作口服避孕藥和促進(jìn)家畜生長(zhǎng)的同化激素，在維持蛋白質(zhì)副特征和蛋白質(zhì)同化方面具有重要的作用.但是，如果人體長(zhǎng)期大量攝入此激素，則可能使人體的生殖機(jī)能和生殖器官出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，導(dǎo)致性早熟、女性化，抑制骨骼和精子的發(fā)育等傷害［2］.另外，炔雌醇還可能通過(guò)魚(yú)肉、奶制品等食物危害人體健康，嚴(yán)重者甚至能誘發(fā)癌癥等疾病［3］.高濃度的炔雌醇同樣會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)等海生生物的染色體表達(dá)等，從而對(duì)魚(yú)類(lèi)的繁殖起到一定程度的危害作用，間接給人類(lèi)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失和生命傷害.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是指通過(guò)干擾生物天然激素的水平，對(duì)免疫系統(tǒng)、生物生殖系統(tǒng)等功能產(chǎn)生影響的外源性物質(zhì).炔雌醇被認(rèn)為是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，常以藥物原形或其代謝產(chǎn)物形式隨排泄物排放到環(huán)境中.炔雌醇在體內(nèi)代謝后失活，但在污水中細(xì)菌的作用下又會(huì)被激活［4］，為重要的環(huán)境污染物之一.因此，炔雌醇的副作用引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注和研究［5］，對(duì)環(huán)境土壤或水樣中的炔雌醇的含量進(jìn)行研究檢測(cè)具有重要意義.

目前檢測(cè)炔雌醇常用的方法有液相色譜法［6］、質(zhì)譜法［7－9］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［10］、酶聯(lián)免疫分析方法［11－12］等.這些檢測(cè)方法能夠較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)炔雌醇的檢測(cè)并且具有較高的選擇性和靈敏度，但色譜分析方法對(duì)檢測(cè)溶液的要求較嚴(yán)格，常常需要復(fù)雜、繁瑣的前處理步驟［13－14］，并且所使用的檢測(cè)儀器大型、昂貴，需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行分析檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)炔雌醇的快速檢測(cè);而酶聯(lián)免疫分析方法雖然具有較好的選擇性，避免了許多背景物質(zhì)帶來(lái)的干擾，但是其實(shí)驗(yàn)操作步驟還是相對(duì)較繁瑣，同樣無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)炔雌醇的高效、快速檢測(cè).因此，有必要設(shè)計(jì)出一種能夠操作步驟簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)炔雌醇的簡(jiǎn)便傳感器.

炔雌醇分子結(jié)構(gòu)中帶有一個(gè)端炔基團(tuán)，因此可以與帶有疊氮基團(tuán)的疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應(yīng).實(shí)驗(yàn)著眼于一種快速且簡(jiǎn)易檢測(cè)環(huán)境中炔雌醇的研究設(shè)想，基于CuAAC反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)了一種能夠快速檢測(cè)炔雌醇的熒光傳感器.將炔雌醇作為CuAAC反應(yīng)中的反應(yīng)物之一，其質(zhì)量濃度大小與反應(yīng)前后熒光的變化成一定的定量關(guān)系，因此通過(guò)檢測(cè)體系熒光信號(hào)的變化進(jìn)而檢測(cè)炔雌醇，并進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光的測(cè)定利用Eclipse熒光分析光譜儀(Varian公司，美國(guó))，熒光分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)參數(shù):電壓650 V，λex=395 nm(slit 10 nm)，λem=400～550 nm(slit 10 nm).核磁共振波譜儀(AVANCE III 500，Bruker，瑞士)用于核磁共振氫譜檢測(cè);質(zhì)譜采用離子阱質(zhì)譜儀(DECAX－30000 LCQ Deca XP，ThermoFinnigan，美國(guó))測(cè)量;傅立葉紅外光譜儀(Nicolet 6700，Thermo Scientific，美國(guó))用于紅外光譜掃描.

抗壞血酸鈉、五水硫酸銅、2，4－二羥基苯甲醛、N－乙酰基甘氨酸、無(wú)水乙酸鈉、乙酸酐，以及丙酮購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;疊氮化鈉購(gòu)自阿爾法埃莎中國(guó)有限公司;炔雌醇(EE2)購(gòu)自上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;3－疊氮基－7－羥基香豆素根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法合成［15］.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

3－疊氮基－7－羥基香豆素化合物采用Wang課題組提出的方法［15］進(jìn)行制備，具體步驟如下:分別稱(chēng)取1.38 g 2，4－二羥基苯甲醛和1.12 g N－乙酰甘氨酸、無(wú)水乙酸鈉至50 mL乙酸酐溶液中，并超聲溶解，然后回流攪拌4 h，反應(yīng)完成后，所得混合物倒入冰水中，得到黃色沉淀，過(guò)濾取黃色沉淀，并用冰水清洗沉淀物，然后再在30 mL鹽酸和乙醇的混合液(體積比2∶1)中回流1 h，反應(yīng)完成后，采用冰浴將上述溶液冷卻，并用20 mL冰水稀釋上述溶液;加入20 mmol亞硝酸鈉，攪拌10 min后，再加入30 mmol疊氮化鈉，攪拌20 min.經(jīng)過(guò)濾、減壓干燥后得到的棕色固體為3－疊氮－7羥基香豆素化合物.

利用叔丁醇溶解疊氮香豆素固體粉末，配制5 mmol·L－1疊氮香豆素溶液.用二次水分別配制1 mmol·L－1硫酸銅溶液和0.1 mol·L－抗壞血酸鈉溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用).用溶劑丙酮溶解炔雌醇固體粉末，配制不同濃度的炔雌醇溶液.在200 μL的PBS緩沖溶液中先后加入5 μL、5 mmol·L－1疊氮香豆素溶液，5 μL含有不同質(zhì)量濃度炔雌醇的溶液(包含炔雌醇質(zhì)量濃度為0的空白對(duì)照組溶液)，5 μL、1 mmol·L－1硫酸銅溶液和5 μL、0.1 mol·L－1抗壞血酸鈉溶液，振搖混勻后室溫下反應(yīng)1 h.檢測(cè)反應(yīng)后溶液的熒光信號(hào).

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的基于CuAAC檢測(cè)炔雌醇環(huán)境干擾物熒光傳感器的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示.

檢測(cè)目標(biāo)物炔雌醇是帶有端炔基團(tuán)的分子化合物，在硫酸銅和抗壞血酸鈉存在的條件下，能夠與帶有疊氮基團(tuán)的疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應(yīng)，生成具有強(qiáng)熒光信號(hào)的化合物.通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)前后熒光信號(hào)的變化，達(dá)到檢測(cè)炔雌醇的目的.

2.2 炔雌醇和雌二醇對(duì)比研究

為了探究上述設(shè)計(jì)的傳感器的可行性，實(shí)驗(yàn)選擇了和炔雌醇結(jié)構(gòu)相似、僅比炔雌醇缺少一個(gè)端炔基團(tuán)的另外一種雌性激素雌二醇，進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(a)所示，隨著炔雌醇質(zhì)量濃度的增大，體系熒光強(qiáng)度逐漸增大;而對(duì)于雌二醇，當(dāng)其質(zhì)量濃度增大時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，如圖2(b)所示.該對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炔雌醇因具有端炔基團(tuán)而能夠同疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應(yīng)，從而使熒光增強(qiáng)，而與炔雌醇結(jié)構(gòu)相似的雌二醇由于不具有端炔基團(tuán)而無(wú)法與疊氮香豆素發(fā)生CuAAC反應(yīng).因此，上述構(gòu)建的基于CuAAC檢測(cè)炔雌醇的傳感器原理可行.

2.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了獲得最佳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)中影響較大的條件進(jìn)行了優(yōu)化.首先，對(duì)CuAAC反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化.如圖3(a)所示，熒光強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到60 min之后，體系的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定.因此，實(shí)驗(yàn)選擇60 min作為CuAAC反應(yīng)的時(shí)間.然后，對(duì)疊氮香豆素的濃度進(jìn)行優(yōu)化.如圖3(b)所示，隨著疊氮香豆素濃度的增大，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度(即F/F0，F(xiàn)為不同濃度的疊氮香豆素與炔雌醇反應(yīng)后溶液的熒光信號(hào)，F(xiàn)0為沒(méi)有炔雌醇參加反應(yīng)、相應(yīng)濃度下疊氮香豆素的熒光信號(hào))先增強(qiáng)后減小，當(dāng)疊氮香豆素濃度為0.125 mmol·L－1時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大.出現(xiàn)此趨勢(shì)現(xiàn)象的原因，可能是因?yàn)榀B氮香豆素本身具有微弱的熒光，當(dāng)疊氮香豆素的濃度增大，體系的背景熒光也劇烈增強(qiáng)，導(dǎo)致F/F0的值增大得不夠明顯甚至減小.因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.125 mmol·L－1作為疊氮香豆素參與反應(yīng)的濃度.第三，對(duì)硫酸銅溶液的濃度進(jìn)行優(yōu)化，如圖3(c)所示，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度(即F/F0，F(xiàn)為不同濃度的Cu(II)參加反應(yīng)后溶液的熒光信號(hào)，F(xiàn)0為沒(méi)有Cu(II)參加的溶液的熒光信號(hào))隨著Cu(II)濃度的增大先是劇烈增大后下降，當(dāng)Cu(II)濃度為0.25 μmol·L－1時(shí)，相對(duì)熒光值達(dá)到最大.出現(xiàn)此趨勢(shì)現(xiàn)象的原因可能是過(guò)量的Cu(II)會(huì)猝滅體系的熒光，使得檢測(cè)到的熒光信號(hào)減小.因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.25 μmol·L－1作為Cu(II)參與反應(yīng)的濃度.

最后，對(duì)還原劑抗壞血酸鈉(SA)進(jìn)行了優(yōu)化.如圖3(d)所示，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度(即F/F0，F(xiàn)為不同濃度的抗壞血酸鈉參加反應(yīng)后溶液的熒光信號(hào)，F(xiàn)0為沒(méi)有SA參加的溶液的熒光信號(hào))隨著SA濃度的增大先逐漸增大后趨于穩(wěn)定(略有下降)，當(dāng)SA濃度大于2.5 mmol·L－1時(shí)，熒光強(qiáng)度已基本趨于穩(wěn)定.因此，實(shí)驗(yàn)選擇2.5 mmol·L－1作為SA參與反應(yīng)的濃度.

2.4 線性范圍與檢測(cè)限

在最優(yōu)條件下，對(duì)傳感器的線性范圍和檢測(cè)限進(jìn)行了探究.如圖4所示，體系的熒光強(qiáng)度隨著炔雌醇質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，并且在0.1～2.5 μg·L－1范圍內(nèi)，體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度與炔雌醇的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系.線性方程為F/F0=1.202 7+0.343 3 ρ(μg·L－1)(其中F為不同質(zhì)量濃度的炔雌醇參加反應(yīng)后溶液的熒光信號(hào)，F(xiàn)0為沒(méi)有炔雌醇參加反應(yīng)的溶液的熒光信號(hào);ρ為炔雌醇的質(zhì)量濃度)，如圖5所示，相關(guān)系數(shù)R為0.997 1，傳感器的檢測(cè)限為0.05 μg·L－1.

2.5 傳感器的重現(xiàn)性與選擇性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)對(duì)傳感器的重現(xiàn)性做了考察，制備了5組平行檢測(cè)炔雌醇的傳感器(1.0 μg·L－1)，測(cè)得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.6%，表明該傳感器具有較好的重現(xiàn)性.

為了探究該傳感器的選擇性，實(shí)驗(yàn)選擇了除炔雌醇之外的3種不同環(huán)境干擾物(己烷雌酚、雙酚A、雌二醇)作為干擾實(shí)驗(yàn).如圖6所示，己烷雌酚、雙酚A、雌二醇對(duì)傳感器幾乎沒(méi)有熒光響應(yīng)，只有炔雌醇熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(其中己烷雌酚、雙酚A、雌二醇的質(zhì)量濃度均為50 μg·L－1，炔雌醇質(zhì)量濃度為0.5 μg·L－1).結(jié)果表明，該傳感器對(duì)炔雌醇的檢測(cè)具有較好的選擇性.

2.6 水樣添加回收率實(shí)驗(yàn)

基于傳感器的檢測(cè)原理，實(shí)驗(yàn)對(duì)超純水、自來(lái)水、河水(福建閩江)3種水樣分別檢測(cè)了炔雌醇的質(zhì)量濃度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，采用以上實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炔雌醇的方法，3種水樣中均未檢測(cè)出炔雌醇.分別對(duì)3種水樣做3個(gè)不同水平(0.25、0.50、2.5 μg·L－1)的添加回收率實(shí)驗(yàn).得到的回收率為94%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4%～7%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較理想，說(shuō)明該檢測(cè)方法在復(fù)雜實(shí)際樣的檢測(cè)中是可行的.

表1 水樣中炔雌醇的檢測(cè)Tab.1Analysis of ethinylestradiol in water samples

3 結(jié)論

利用CuAAC反應(yīng)，構(gòu)建一種高選擇性、快速檢測(cè)環(huán)境干擾物炔雌醇的熒光傳感器.該檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，無(wú)需太多的處理步驟，具有即時(shí)性.將該傳感器應(yīng)用于水環(huán)境中炔雌醇的檢測(cè)，結(jié)果較理想，具有一定的實(shí)用性.

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(責(zé)任編輯:洪江星)

Fluorescence sensor for ethinylestradiol based on click chemistry

WANG Chunmei1，LU Lijun2，LIN Zhenyu2
(1.College of Chemistry and Material Science，Longyan University，Longyan，F(xiàn)ujian 364000，China; 2.College of Chemistry，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350116，China)

Ethinylestradiol is an environmental distractor，high concentrations of ethinylestradiol may cause certain harm to environment and biological.In this study，a selective fluorescent sensor based on click chemistry for ethinylestradiol detection of had been proposed.Ethinylestradiol has the terminal alkyne which can react with 3－azido－7－h(huán)ydroxycoumarin through Cu(I)catalysed alkyne－azide cycloaddition(CuAAC)reaction to form a strong fluorescent compound.The fluorescence increased factor (represented by F/F0)of the system exhibited a good linear relationship with the mass concentration of ethinylestradiol in the range of 0.1 to 2.5 μg·L－1and the detection limit was 0.05 μg·L－1(S/N=3).

ethinylestradiol;3－azido－7－h(huán)ydroxycoumarin;Cu(I);fluorescent sensor

TP212.2

A

10.7631/issn.1000－2243.2016.06.0901

1000－2243(2016)06－0901－05

2016－07－04

林振宇(1976－)，研究員，主要從事化學(xué)傳感器方面的研究，zylin@fzu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21175024)