馮光維，劉志東，祁東利，皮佳鑫，顧　星，張　謙，黃　瑞

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津　300193；2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，都勻　558000）

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UPLC法同時測定地錦草中4種指標(biāo)成分的含量*

馮光維1，2，劉志東1，祁東利1，皮佳鑫1，顧星1，張謙1，黃瑞1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津300193；2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，都勻558000）

摘要：［目的］建立同時測定地錦草藥材中沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚4種指標(biāo)成分的超高液相色譜法（UPLC）。［方法］采用UPLC法，色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為甲醇-乙腈4∶6（A）-0.2%甲酸水（B）溶液，梯度洗脫：0～3 min，5%A；3～4 min，5%～17%A；4～19 min，17%A；19～42 min，17%～30% A；42～50 min，30%～34%A；50～55 min，34%～70%A，體積流量0.2 mL/min；檢測波長為0～4 min，270 nm；4～55 min，360nm，柱溫30℃。［結(jié)果］4種成分均達(dá)到基線分離，各成分在線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r＞0.999 7）；回收率在96.5%～102.9%。［結(jié)論］建立的測定方法準(zhǔn)確靈敏、重復(fù)性好，能較全面地評價地錦草藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：UPLC；同時測定；地錦草；含量

地錦草為大戟科植物地錦（Euphorbia humifusa Willd.）或斑地錦（Euphorbia maculate L.）的干燥全草，分布于全國各地，具有清熱解毒、利濕退黃、活血止血的功效，臨床上主要治療細(xì)菌性痢疾、腸炎、癰腫疔瘡和濕熱黃疸等［1-2］。地錦草中化學(xué)成分主要是沒食子酸、鞣花酸等有機(jī)酸類和槲皮素、山奈酚等黃酮類化合物［3-8］，其中沒食子酸具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等活性［9］，鞣花酸具有抗氧化、抗腫瘤、抗突變等活性［10］，槲皮素、山奈酚均具有抗炎、抗氧化、抗菌等活性［11-12］。中國藥典以槲皮素作為地錦草的質(zhì)控指標(biāo)，同時有文獻(xiàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測定地錦草中成分［13-15］，但對其多指標(biāo)成分的測定較少報道。超高效液相色譜法（UPLC）測定具有方法簡便，分析時間短，溶劑消耗少等特點(diǎn)，尤其適用于中藥材多指標(biāo)成分的定量檢測。本研究采用UPLC技術(shù)［16-20］，建立了UPLC法測定地錦草中沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚含量的方法，更加全面的控制地錦草藥材的質(zhì)量，對地錦草制劑開發(fā)及質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1儀器與材料

Waters Acquity超高效液相色譜儀，配置四元高壓泵、在線脫氣裝置、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV檢測器，美國Waters公司；Sorvall ST16R高速離心機(jī)，德國Thermo Scientific公司；Milli—Q超純水機(jī)，德國Millipore公司；KQ-300B超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；Mettler Toledo XP205電子分析天平，Mettler Toledo儀器有限公司；FA124型天平，上海舜宇恒平有限公司。

沒食子酸（批號110831-201204）、槲皮素（批號100080-201408）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；鞣花酸（批號W16-5-0）、山奈酚（批號W13-5-9）對照品由天津中新藥業(yè)有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。甲醇、乙腈均為色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；水為超純水；甲酸為色譜純，購自日本東京化成工業(yè)株式分社。地錦草藥材分別收集于貴州、河南、安徽、廣西等產(chǎn)地，共12批，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院劉志東博士鑒定為大戟科植物地錦（Euphorbia humifusa Willd.）的干燥全草。藥材信息見表1。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm），檢測波長為0～4min，270 nm，4～55 min，360 nm；柱溫30℃；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL；流動相為甲醇∶乙腈4∶6（A）-0.2%甲酸水（B）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表1　12批地錦草藥材來源

表2　梯度洗脫程序表

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚對照品適量，加甲醇制成濃度分別為:412.0、608.0、200.0、10.0 mg/L混合對照品儲備液。分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.6、2.0 mL儲備液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得系列混合對照品溶液，避光保存。

2.2.2供試品溶液的制備稱取地錦草粉末（過三號篩）2.0 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲處理45 min（頻率40 KHz，功率300 W），放冷、稱質(zhì)量，加80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，12000r/min離心10min，用0.2 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)分別精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液2 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果4種被測成分均能達(dá)到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計均超過10 000，峰形較好。UPLC色譜圖見圖1。

圖1　4種混合對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的UPLC色譜圖

2.4線性關(guān)系考察在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別精密量取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別按照色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表3。

表3　4種指標(biāo)成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5精密度實(shí)驗(yàn)取混合對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為2 μL，以對照品峰面積進(jìn)行計算，沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚峰面積的RSD分別為0.66%、0.55%、0.80%、1.39%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取待測地錦草（編號S2）供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚的峰面積，按峰面積計算得RSD分別為0.80%、0.97%、1.18%、1.33%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批次地錦草藥材粉末（編號S2）約2.0 g，平行稱定6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液6份，每份精密吸取2 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，分別測得沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.80%、1.40%、1.76%、1.21%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已測定的地錦草藥材（編號S2）粉末6份，每份1.0 g，精密稱定，每份加入相同量的沒食子酸、鞣花酸、槲皮素、山奈酚對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測定，結(jié)果平均回收率分別為96.5%、102.9%、96.9%、97.0%，RSD分別為1.34%、1.22%、0.91%、1.30%。

2.9樣品測定取收集于貴州、河南、安徽、廣西等不同產(chǎn)地的12批地錦草藥材，分別稱取地錦草藥材粉末約2.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，平行3份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，并計算樣品中4種指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表4。

表4　地錦草藥材中4種指標(biāo)成分含量測定結(jié)果（n=3）

結(jié)果表明，貴州、河南、安徽、廣西產(chǎn)地12批次的地錦草藥材中4種指標(biāo)成分的含量存在一定差異，其中沒食子酸含量差異較大，以廣西產(chǎn)的含量最高，這可能與土壤、環(huán)境、采收季節(jié)、加工過程等有關(guān)。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇∶乙腈（4∶6）-0.1%甲酸水混合溶劑系統(tǒng)對地錦草成分分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇∶乙腈（4∶6）-0.1%甲酸水混合溶劑系統(tǒng)能夠使色譜峰達(dá)到完全分離。同時考察了甲酸用量對色譜峰對稱性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.2%甲酸水溶液對色譜峰對稱性較好，且甲酸易揮發(fā)的性質(zhì)適用于UPLC的測定，故最終確定甲醇∶乙腈（4∶6）-0.2%甲酸水溶液作為流動相。

在樣品處理過程中，考察了甲醇、80%甲醇、50%甲醇3種溶劑的提取效率，結(jié)果表明80%甲醇作為提取溶劑時，各指標(biāo)成分的含量較高，故選擇80%甲醇作為提取溶劑。

超聲提取各成分，考察了30、45、60 min超聲時間的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲30 min時各成分的含量相對較低；45 min和60 min各成分的含量基本一致，故提取時間選擇45 min。

測定波長的選擇上，沒食子酸的最大吸收為270 nm，鞣花酸、槲皮素、山奈酚均在360 nm時有強(qiáng)吸收，并且基線平穩(wěn)，故確定其測定波長為0～4 min時波長為270 nm，4～55 min時波長為360 nm。

《中國藥典》2015年版采用酸水解的方法對地錦草中黃酮苷進(jìn)行降解，測定降解產(chǎn)物槲皮素的含量；而本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑直接提取藥材中的有效成分進(jìn)行含量測定，更能準(zhǔn)確反映各指標(biāo)成分在藥材中的真實(shí)含量。

本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC法測定地錦草中4種指標(biāo)成分的方法，分析了4個產(chǎn)地12批藥材中有機(jī)酸和黃酮類成分的含量，黃酮類成分含量地域差異較小，而有機(jī)酸類成分含量差異較大，為地錦草藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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中圖分類號：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-9043（2016）03-0196-04

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2016.03.12

收稿日期：（2016-03-01）

*基金項(xiàng)目：黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校科研基金資助項(xiàng)目（QNYZ2014014）。

作者簡介：馮光維（1982-），男，少數(shù)民族骨干碩士，講師，主要從事中藥制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

通訊作者：劉志東，E-mail:lonerliuzd@163.com。

Simultaneous determination of four components in Euphorbia Humifusa Willd.by UPLC

FENG Guang-wei1，2，LIU Zhi-dong1，QI Dong-li1，PI Jia-xin1，GU Xing1，ZHANG Qian1，HUANG Rui1
（1.EngineeringResearch Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Ministry of Education，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun，Guizhou，558000，China）

Abstract:［Objective］To establish an UPLC method for simultaneous determination four index components such as gallic acid，ellagic acid，quercetin and kaempferol in Euphorbia Humifusa Willd.［Methods］A chromatographic separation method was established with Acquity UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7μm）with methanol-acetonitrile（40∶60，A）-0.2%formic acid（B）as mobile phases at the flow rate of 0.2 mL/min.The gradient elution was carried out as follows:0～3 min，5%A；3～4 min，5%～17%A；4～19min，17%A；19～42 min，17%～30%A；42～50 min，30%～34%A；50～55 min，34%～70%A.The detection wavelength was 270 nm at 0～4 min and 360 nm at 4～55 min，and the column temperature was 30℃.［Results］The four index components were well separated and each component had a good linear relationship in the liner range（r＞0.999 7）；and the recovery was in the range of 96.5%～102.9%.［Conclusion］The method is accurate，sensitive and repeatable for the comprehensive quality control of Euphorbia Humifusa Willd.

Key words:UPLC；simultaneous determination；Euphorbia HumifusaWilld.；content