周紅宇++楊德

摘要：利用水酶法，以油茶籽粕為原料，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化了纖維素酶酶解提取茶皂素工藝，并對(duì)殼聚糖-蛋白酶聯(lián)用純化茶皂素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，蛋白酶處理可顯著降低提取液中蛋白質(zhì)含量和殼聚糖絮凝時(shí)茶皂素?fù)p失率；各因素對(duì)油茶皂素提取率影響順序?yàn)槊柑砑恿?料液比>提取溫度>提取時(shí)間，最佳提取工藝為酶添加量 6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間120 min。

關(guān)鍵詞：水酶法；茶皂素；提取純化

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0362-03

茶皂素別稱茶皂苷，是存在于山茶科（茶、油茶、山茶）植物中的一類五環(huán)三萜皂苷類物質(zhì)，是一種性能優(yōu)良的天然非離子型表面活性劑，在工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛用途[1-2]。目前，提取茶皂素的方法主要有水浸提法、有機(jī)溶劑提取法、吸附法、超聲波提取法、微波輔助提取法等，其中有機(jī)溶劑提取法應(yīng)用廣泛，但存在工藝復(fù)雜、條件要求高、能耗高、環(huán)境不友好等問(wèn)題，限制了其產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。因此尋找簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效且適合工業(yè)化生產(chǎn)的茶皂素提取純化方法非常必要。本研究以油茶籽粕為原料，以水代替有機(jī)試劑進(jìn)行油茶皂素提取，探索酶解工藝、殼聚糖絮凝工藝在茶皂素提取上的應(yīng)用，旨在為茶皂素工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

油茶籽粕由湖北省廣水市涂氏農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供，70 ℃ 烘干后粉碎，過(guò)40目篩，置于干燥器中備用。15 000 μ/g纖維素酶（國(guó)藥控股有限公司）、10 000 μ/g木瓜蛋白酶（上海沃凱生物技術(shù)有限公司）、茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%、上海紫一試劑廠）；試劑均為分析純。HW.SY21-K電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）、FA1004B分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、GL-25MS高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司）、TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1單因素試驗(yàn)研究酶添加量、料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間等4個(gè)因子對(duì)茶皂素溶出率的影響。

1.2.1.1酶添加量對(duì)茶皂素溶出率的影響在料液比為 1 g ∶10 mL，酶解溫度為 55 ℃，酶解時(shí)間2.5 h條件下，考察酶添加量對(duì)油茶皂素提取率的影響。

1.2.1.2料液比對(duì)茶皂素溶出率的影響在酶用量 4 mg/g，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間2.5 h條件下，考察料液比對(duì)油茶皂素提取率的影響。

1.2.1.3酶解溫度對(duì)茶皂素溶出率的影響在酶用量 4 mg/g，料液比為1 g ∶20 mL，酶解時(shí)間2.5 h 條件下，考察酶解溫度對(duì)油茶皂素提取率的影響。

1.2.1.4酶解時(shí)間對(duì)茶皂素溶出率的影響在酶用量 4 mg/g，料液比為1 g ∶20 mL，酶解溫度為55 ℃條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)油茶皂素提取率的影響。

1.2.2多因素正交試驗(yàn)通過(guò)以上單因素試驗(yàn)，得出每個(gè)單因素的最佳值，設(shè)定不同酶的添加量、提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

1.3測(cè)定方法

1.3.1油茶籽粕成分分析測(cè)定油茶籽粕中水分、總糖、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維、茶皂素含量。

1.3.2茶皂素提取方法稱取處理后的油茶籽粕50 g置于1 000 mL燒杯中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比加入蒸餾水、纖維素酶，設(shè)定提取溫度與提取時(shí)間，提取完成后離心，取上清液備用。

茶皂素提取率=提取液中茶皂素濃度×提取液體積原料質(zhì)量×100%；（1）

1.3.3蛋白酶酶解方法取提取液離心后得到的上清液500 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.5，加入木瓜蛋白酶以除去提取液中的蛋白質(zhì)，酶解條件為：酶添加量1%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間2 h，計(jì)算酶解前后提取液中蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)去除率。

蛋白質(zhì)去除率=酶解前提取液中蛋白質(zhì)濃度-酶解后提取液中蛋白質(zhì)濃度絮凝前提取液中茶皂素濃度×100%；（2）

1.3.4殼聚糖絮凝取蛋白酶酶解前后的提取液100 mL，考察1%殼聚糖溶液添加量及絮凝時(shí)間對(duì)皂素純化效果影響。

茶皂素?fù)p失率=絮凝前提取液中茶皂素濃度-絮凝后提取液中茶皂素濃度絮凝前提取液中茶皂素濃度×100%；（3）

蛋白質(zhì)去除率=絮凝前提取液中蛋白質(zhì)濃度-絮凝后提取液中蛋白質(zhì)濃度絮凝前提取液中茶皂素濃度×100%。（4）

1.3.5其他指標(biāo)參照GB 5009.3—2010 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》規(guī)定的方法測(cè)定水分含量；采用索式提取法測(cè)定脂肪含量；采用濃硫酸-香草醛法[3] 測(cè)定茶皂素含量。采用雙縮脲法[4] 測(cè)定蛋白質(zhì)含量。采用 GB/T 6434—2006 《飼料中粗纖維測(cè)定方法》規(guī)定的方法測(cè)定粗纖維含量。采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量。

2結(jié)果與分析

2.1油茶籽粕主要成分

由表1可知，油茶籽粕總糖含量為31.07%，粗纖維含量17.69%，蛋白質(zhì)含量13.60%，總糖、蛋白質(zhì)含量較高會(huì)對(duì)茶皂素提取、純化產(chǎn)生影響。粗纖維主要由細(xì)胞壁成分組成，其存在會(huì)影響皂素溶出，因此，通過(guò)添加纖維素酶使粗纖維酶解從而促進(jìn)茶皂素溶出。

表1油茶籽粕主要成分含量

指標(biāo)含量（%）水分8.32總糖31.07蛋白質(zhì)13.60脂肪6.50粗纖維17.69茶皂素13.09

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1酶添加量對(duì)油茶皂素提取率的影響不同酶的添加量對(duì)油茶皂素提取率的影響如圖1所示，油茶皂素提取率隨纖維素酶添加量的增加先升高后降低，酶添加量為4 mg/g時(shí)提取率最高，達(dá)到12.79%。纖維素酶可破壞植物的細(xì)胞壁，從而促使茶皂素等成分溶出；另一方面，茶皂素具有親脂性，酶添加量增加時(shí)茶皂素提取率降低可能和脂肪浸出率增加有關(guān)。

2.2.2料液比油茶皂素提取率的影響從圖2可以看出，隨著料液比的增加，茶皂素提取率隨之增加，考慮到后續(xù)濃縮成本，選擇1 g ∶20 mL作為最佳料液比。

2.2.3提取溫度對(duì)油茶皂素提取率的影響由圖3可知，隨著提取溫度的增加，茶皂素提取率先升高后降低，提取溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，提取率最高，因此茶皂素提取工藝的提取溫度確定為55 ℃。在一定范圍內(nèi)，溫度升高時(shí)酶活性增大，水活度增加也更有利于成分溶出；溫度達(dá)到一定高度會(huì)抑制酶活性，導(dǎo)致提取率降低。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)油茶皂素提取率的影響由圖4可知，茶皂素提取率與提取時(shí)間呈正相關(guān)，即提取時(shí)間越長(zhǎng)油茶皂素提取率越高，但90 min后油茶皂素提取率增加趨勢(shì)趨緩，提取時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加能耗，因此選擇120 min作為正交試驗(yàn)提取溫度。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)選定的酶添加量、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等4 個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，考察酶添加量、料液比、提取時(shí)間、提取溫度的綜合作用。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表2、表3可看出，各因素對(duì)油茶皂素提取率影響由大到小為A>B>C>D，試驗(yàn)最優(yōu)條件為A3B3C1D2，即酶添加量6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間120 min。

2.4殼聚糖絮凝純化茶皂素工藝

殼聚糖在烯酸溶液中分子鏈中帶有大量的正電荷，是天然絮凝劑，可以對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子絮凝回收。由圖5、圖6、圖7可知，酶解前，隨著殼聚糖添加量增大，茶皂素?fù)p失率增加，添加3 mL 1%殼聚糖溶液時(shí)茶皂素提取率為957%，蛋白質(zhì)含量下降至140 μg/mL，茶皂素?fù)p失率在25%左右；酶解后殼聚糖絮凝時(shí)茶皂素?fù)p失率顯著降低，添加 3 mL 1%殼聚糖時(shí)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)酶解效率較高，酶解后提取液中蛋白含量下降至63 μg/mL左右，茶皂素?fù)p失率約為10%，相比酶解前蛋白含量下降更顯著，同時(shí)茶皂素?fù)p失率較

低。絮凝時(shí)間延長(zhǎng)，茶皂素?fù)p失率增大，同時(shí)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的去除率也增大，由試驗(yàn)可知，添加3 mL殼聚糖溶液，絮凝4 h即可取得較好的效果。

3結(jié)論

纖維素酶是酶的一種，在分解纖維素時(shí)起生物催化作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖，在食品行業(yè)和環(huán)境行業(yè)均有廣泛應(yīng)用[5-9]。提取茶皂素時(shí)，纖維素酶的加入可增大茶皂素分子向溶劑溶出的通道，從而提高茶皂素提取率。本研究結(jié)果表明，纖維素酶的加入可提高茶皂素水提取的得率，最佳提取工藝為酶添加量6 mg/g，料液比1 g ∶25 mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間120 min。殼聚糖的加入可有效去除提取體系中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，在未經(jīng)蛋白酶酶解的提取體系中，殼聚糖絮凝蛋白質(zhì)等大分子易導(dǎo)致茶皂素?fù)p失率較大，這可能與茶皂素與糖類大分子、蛋白質(zhì)的結(jié)合有關(guān)[10]。蛋白酶酶解后，添加殼聚糖絮凝時(shí)茶皂素?fù)p失率下降，表明蛋白酶處理可作為殼聚糖絮凝除雜前的必要步驟。

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