韓霜

摘要：以國慶小菊金陵豐收為試驗材料，使用的培養(yǎng)基是ME3+150 g/L PEG4000）+100 g/L 蔗糖），添加不同濃度鈣和硼酸，研究不同濃度的鈣和硼酸對國慶菊花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響，旨在獲得菊花花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：硼酸對花粉萌發(fā)率影響明顯，當(dāng)硼酸濃度是100 mg/L時，花粉培養(yǎng)2 h時花粉萌發(fā)率達到最高，為1005%。外源鈣能促進花粉的萌發(fā)，并影響花粉管的生長速度和生長質(zhì)量，一定濃度的鈣使花粉管生長筆直，在鈣濃度為400 mg/L時金陵豐收花粉管生長狀況最佳。外源鈣濃度過高和培養(yǎng)時間過長時，花粉管生長出現(xiàn)細(xì)弱、畸形，而且容易斷落。

關(guān)鍵詞：菊花；離體培養(yǎng)；花粉萌發(fā)率；花粉管生長

中圖分類號：S682.1+10.4+3文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0258-03

菊花（Chrysanthemum morifolium）是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有很高的觀賞價值。我國是菊花的起源中心，擁有3 000余個菊花品種[1]。菊花是異花授粉植物，具有自交不親和特性，花粉生活力是決定雜交結(jié)實的重要因素之一，因此研究花粉活力對指導(dǎo)菊花育種具有重要理論和現(xiàn)實意義[2]?；ǚ鄣拿劝l(fā)與生長[3]要通過吸漲、停滯、花粉管發(fā)端、花粉管迅速伸長這4個階段。研究報道，許多植物的花粉可以在培養(yǎng)基上萌發(fā)，如杜紀(jì)紅等[3]、杜玉虎等[4]、儲立明等[5]分別對桃、榆葉梅、絲瓜等花粉進行了離體培養(yǎng)研究。

國慶菊是菊花中的一種栽培類型，不僅具有生長繁盛、開花期長、分枝性強的優(yōu)點，而且營造景觀效果好、耐鹽堿、成活率高[6]。花粉萌發(fā)和花粉管生長是植物受精的一個重要組成部分，不少研究表明，花粉萌發(fā)時引發(fā)的群體效應(yīng)可由外源鈣離子來替代，這種作用對花粉萌發(fā)和花粉管生長過程很重要[7-8]?；ǚ酃苊劝l(fā)和生長需要硼的作用，花粉管頂端聚集的酯化果膠[9]，是由細(xì)胞壁上聚集了細(xì)胞中多數(shù)的硼，與果膠類物質(zhì)RG-Ⅱ（鼠李半乳糖醛酸-Ⅱ）結(jié)合形成的，這種酸性果膠物質(zhì)有利于頂端的延展，整個花粉管內(nèi)遍布這種酸性的果膠物質(zhì)，使細(xì)胞壁機械強度增大[10]，從而推測，硼酸可能與RG-Ⅱ結(jié)合形成果膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能調(diào)節(jié)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，硼酸可防止酚類物質(zhì)的積累，促進花粉管的生長[11]。本研究對國慶小菊金陵豐收花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基成分及其濃度和萌發(fā)時間進行研究，以期獲得菊花最適宜的離體培養(yǎng)條件，為花粉萌發(fā)和活力測定提供高效、簡便的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為菊花品種金陵豐收，該品種初花期在9月下旬，盛花期在10月中旬，該材料由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花種質(zhì)資源中心提供。

1.2試驗方法

1.2.1花粉采集于晴天中午12：00，采取金陵豐收盛開花朵的花粉，裝到離心管中，避光，備用。

1.2.2花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的確定

1.2.2.1培養(yǎng)基成分以 ME3+150 g/L PEG4000）+100 g/L 蔗糖為培養(yǎng)基[1]，培養(yǎng)基中ME3[12]的基本成分包含大量元素：370 mg/L MgSO4·7H2O、950 mg/L KNO3、412.5 mg/L NH4NO3、175 mg/L KCl、85 mg/L KH2PO4；微量元素：0.83 mg/L KI、7.45 mg/L Na2 EDTA、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L FeSO4·7H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O；維生素B1、維生素B6各1 mg/L。

1.2.2.2 培養(yǎng)基設(shè)置在ME3+150 g/L PEG4000+100g/L 蔗糖的培養(yǎng)基[1]中加入不同濃度的鈣和硼酸，其中硼酸濃度分別為5、50、100、200 mg/L，鈣濃度分別為0、200、400、800 mg/L，以ME3+150 g/L PEG4000+100 g/L 蔗糖+ 0 mg/L 硼酸的培養(yǎng)基為對照（CKⅠ），再分別加入上述濃度的硼酸，得出最適的硼酸濃度A；再加入上述濃度的外源鈣，以ME3+150 g/L PEG4000+100 g/L蔗糖+A濃度硼酸的培養(yǎng)基為對照（CKⅡ），從而得出最適的鈣濃度B。

1.2.3花粉萌發(fā)與花粉管長度檢測

1.2.3.1花粉萌發(fā)方法花粉萌發(fā)方法參照趙宏波等的方法[13加以修改，將采集來的菊花花粉，從離心管里倒出，放于玻璃紙上，然后用毛筆蘸取，輕撒適量的花粉到凹形載玻片的凹槽中，用膠頭滴管吸取培養(yǎng)液2～3滴，滴在盛有花粉的載玻片凹槽中。將培養(yǎng)皿底部墊上1層吸水的濾紙，將載玻片放上，并在兩旁放上吸水的脫脂棉球，用以保濕，蓋上培養(yǎng)皿蓋后放入恒溫箱內(nèi)20 ℃進行培養(yǎng)，定時取出，在顯微鏡下（10×10）觀察統(tǒng)計花粉的萌發(fā)率并用顯微測微尺測量花粉管的長度。

1.2.3.2花粉萌發(fā)率將花粉放于不同濃度培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0.5、1、2 、4 h后從恒溫培養(yǎng)箱里取出凹形載玻片在顯微鏡下觀察。每種試驗處理重復(fù)3次，每次重復(fù)隨機觀察3個視野，每個視野觀察的花粉總數(shù)不少于60粒，以花粉管的長度大于花粉粒的直徑為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[1]，以花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù)×100%為計算方法，最后將花粉的萌發(fā)率進行統(tǒng)計。

1.2.3.3顯微測微尺的使用顯微測微尺包括鏡臺測微尺和目鏡測微尺，測量前，要先進行校正，鏡臺測微尺的中央有1個全長1 mm的刻度標(biāo)尺，等分成100個小格，每小格的長度為0.01 mm，可以用它來矯正目鏡測微尺每小格的長度。校正后的目鏡測微尺以每小格所代表的實際長度作為測量的尺度。

1.2.3.4花粉管長度檢測將花粉放于不同濃度培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0.5、1.0、2.0、4.0 h后從恒溫培養(yǎng)箱里取出凹形載玻片在顯微鏡下觀察。每種試驗處理重復(fù)3次，每個視野隨機測量20個花粉管的長度，用顯微鏡的測微尺測量花粉管長度，計算隨機測量的20個花粉管長度的平均值。

1.3統(tǒng)計分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS v17.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行統(tǒng)計分析，處理之間差異顯著水平用單因素鄧肯檢驗，P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1硼酸對花粉萌發(fā)的影響

金陵豐收花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的升高而增加，與對照相比，在培養(yǎng)時間0～1 h內(nèi)，5、50 mg/L處理中的花粉萌發(fā)率增加最顯著。不同硼酸濃度處理的花粉萌發(fā)率差異顯著，其中100 mg/L 2 h時的花粉萌發(fā)率達到10.050%，比50、5 mg/L花粉萌發(fā)率分別增加了89%、92%。當(dāng)硼酸濃度升高到200 mg/L時，每個時間段的萌發(fā)率基本相同，而且與 100 mg/L 硼酸濃度相比，花粉萌發(fā)率有所下降（表1）。說明硼酸只有在適宜的濃度下，才會對花粉萌發(fā)率有一定促進作用，高濃度的硼酸對花粉的萌發(fā)反而有一定的抑制作用。

2.2硼酸對花粉管生長的影響

硼酸對花粉管生長具有明顯影響（圖1）。在無硼酸的培養(yǎng)基上，花粉管細(xì)長且彎曲（圖1-d），加上硼酸之后，花粉管生長變粗而且直（圖1-h）。不同濃度硼酸對金陵豐收花粉管生長的影響達到顯著水平，在2 h之內(nèi)，增加硼酸濃度金陵豐收花粉管有伸長的趨勢，但2 h以后，花粉管的伸長速度明顯緩慢。硼酸200 mg/L時的每個時間段的平均花粉長度與100 mg/L的相比無明顯的變化。試驗中發(fā)現(xiàn)在無硼酸和有硼酸的條件下都出現(xiàn)了1個花粉粒長出2根花粉管的現(xiàn)象（圖1-d，圖1-h，紅色箭頭）。在無硼條件下，隨著時間的延長花粉管有伸長趨勢，但添加硼之后能促進金陵豐收花粉管的生長（表2）。

2.3鈣對花粉萌發(fā)的影響

鈣顯著提高了金陵豐收花粉萌發(fā)率，隨著鈣濃度的升高花粉萌發(fā)率顯著增加，以鈣濃度為400 mg/L處理中的花粉萌發(fā)率最高，當(dāng)其濃度增加到800 mg/L時，花粉的萌發(fā)率反而下降（表3）。

2.4鈣對花粉形態(tài)和花粉管生長的影響

培養(yǎng)基中添加Ca2+對花粉管生長的影響不顯著（表4），對花粉管品質(zhì)的影響較大，外源鈣濃度過高以及離體培養(yǎng)時間過長都不適合金陵豐收花粉管生長，當(dāng)外源Ca2+達到400 mg/L時，在0～1 h期間花粉管生長正常（圖2-e，圖2-f），2 h后花粉生長出現(xiàn)異常（圖2-g，圖2-h）；當(dāng)外源Ca2+達到800 mg/L時花粉管末端細(xì)弱、畸形（圖2-j至圖2-l）。

3討論

硼在植物體內(nèi)含量低，分布不均勻，以花中含量最高，參與果膠物質(zhì)的合成，有利于花粉管壁的形成，因此有利于花粉管的生長[14]。迄今有關(guān)硼酸對花粉萌發(fā)和花粉管生長的研究報道較多，均認(rèn)為一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管生長[15]。趙宏波等研究認(rèn)為菊花花粉在離體培養(yǎng)0.5～2.0內(nèi)，萌發(fā)率呈直線上升趨勢，2 h之后花粉的萌發(fā)率增加不顯著，外源硼和鈣對金陵豐收花粉萌發(fā)都是必需的[13]，本研究得出以上相同的結(jié)論。本研究還發(fā)現(xiàn)，一定濃度的鈣能顯著提供花粉萌發(fā)率并使生長健壯，但濃度過高或培養(yǎng)時間過長時花粉萌發(fā)率反而受到抑制，2 h后花粉細(xì)弱畸形。不同植物種類的花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的最適硼酸濃度不同，杜紀(jì)紅等研究表明，0.1%的硼酸可提高大多數(shù)桃品種花粉萌發(fā)率[3]，本研究發(fā)現(xiàn)100 mg/L）硼酸對金陵豐收萌發(fā)最有利。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.05.075