余振宙++陶鴻++占?jí)舻?/p>

摘要：根據(jù)四唑（2，3，5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，縮寫(xiě)TTC）染色法測(cè)定種子生活力的原理，研究不同濃度四唑溶液，不同染色溫度和不同染色時(shí)間對(duì)京茄218茄子種子生活力測(cè)定的影響，摸索出測(cè)定茄子種子生活力的最佳條件。結(jié)果表明，四唑溶液濃度，染色溫度，染色時(shí)間三者之間存在一定的相關(guān)性，通過(guò)改變?nèi)咧械囊徽呋騼烧呖梢赃_(dá)到改變其他兩者或一者的目的，因此，可根據(jù)實(shí)際需要來(lái)確定測(cè)定條件。比較四唑染色法測(cè)定京茄218茄子種子生活力的不同條件，本研究提出處理組合11（浸種溫度20 ℃、浸種時(shí)間18 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時(shí)間18 h）和處理組合23（浸種溫度30 ℃、浸種時(shí)間4 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時(shí)間18 h）為最理想的2組處理組合，為T(mén)TC法快速測(cè)定京茄218茄子種子生活力的適宜方法。

關(guān)鍵詞：四唑染色；茄子種子；生活力

中圖分類(lèi)號(hào)： S641.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0206-03

收稿日期：2015-04-09

基金項(xiàng)目：北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（編號(hào)：QNJJ201211）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAK26B03）；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：KJCX201202001、KJCX20140111）；北京市科委重大科研項(xiàng)目（編號(hào)：D131100000413001）。

作者簡(jiǎn)介：：余振宙（1989—），男，安徽潛山人，碩士。E-mail：291765585@qq.com。

通信作者：孟淑春，副研究員，主要從事蔬菜種質(zhì)資源和種子技術(shù)研究。E-mail：mengshuchun@nercv.org。種子生活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是種用價(jià)值的主要組成部分，與種子田間出苗率密切相關(guān)，是反映種子生命過(guò)程中十分重要的特性之一[1]。由于采用常規(guī)的發(fā)芽試驗(yàn)測(cè)定發(fā)芽力需要的時(shí)間較長(zhǎng)，而種子壽命長(zhǎng)短各異，為了確定種子是否能用于播種及確定播種量，有必要進(jìn)行種子生活力的快速高效率測(cè)定。目前種子生活力的快速測(cè)定法主要有四唑（2，3，5-氯化三苯基四氮唑；2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法，溴麝香草酚蘭（BTB）法和紫外熒光法等。其中種子生活力TTC測(cè)定法現(xiàn)已被世界各國(guó)廣泛使用，其原理為有生活力的種子胚細(xì)胞含有脫氫酶，具有脫氫還原作用，被種子吸收的無(wú)色TTC接受活種子呼吸過(guò)程中脫氫酶產(chǎn)生的氫，而變成還原態(tài)的紅色穩(wěn)定不擴(kuò)散物質(zhì)[2]，即不溶于水的三苯基甲腙（TTF），而無(wú)生活力的種子則無(wú)此反應(yīng)，故無(wú)染色出現(xiàn)，由此可按胚組織的染色情況區(qū)分是否有生活力的種子[3]。

茄子（Solanum melongena L.） 為茄科（Solanaceae）茄屬（Solanum）中以漿果為產(chǎn)品的一年或多年生草本植物，起源于亞洲南部熱帶地區(qū)，古印度為其最早馴化地[4]，中國(guó)栽培茄子歷史悠久，是茄子第二起源地，擁有豐富的茄子種質(zhì)資源[5]。茄子是世界上第四大蔬菜作物，我國(guó)是世界上最大的茄子生產(chǎn)國(guó)，占世界總面積的49.16%[6]。茄子種植區(qū)域廣，種子用量大，但是休眠現(xiàn)象比較普遍[7]。如何快速測(cè)定茄子種子生活力，確定茄子種子最大發(fā)芽潛力，評(píng)定種子質(zhì)量，成為當(dāng)前休眠茄子種急需解決的主要問(wèn)題?！秶?guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（international rules for seed testing）已列入農(nóng)業(yè)、園藝和林木的部分種子種類(lèi)和應(yīng)用范圍內(nèi)各類(lèi)種子的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[3]，但迄今為止工作比較集中于木本植物及大田作物種子，如水稻[8]、小麥[9]、玉米[10]等。蔬菜種子生活力測(cè)定方法的研究極少，僅在番茄[11]、苦瓜[12]、冬瓜[13]等方面有報(bào)道。目前，除番茄屬作物外，其他蔬菜種子尚未列入《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》。我國(guó)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》和《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》中均未對(duì)茄子種子的TTC染色進(jìn)行詳細(xì)描述，茄子種子生活力的具體鑒定標(biāo)準(zhǔn)和茄子種子四唑染色圖譜尚未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)以京茄218茄子種子為材料，研究比較TTC法快速測(cè)定茄子種子生活力的適宜條件，快速預(yù)測(cè)茄子種子最大發(fā)芽潛力，以解決茄子種子質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)和設(shè)定田間播種量等生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題，為茄子種子生產(chǎn)和銷(xiāo)售提供參考依據(jù)，為茄子種子生活力TTC測(cè)定法早日列入我國(guó)的《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》和《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1種子材料試驗(yàn)所用種子為京茄218茄子種子，2014年9月新采收，由北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心提供。

1.1.2試驗(yàn)儀器和藥品試驗(yàn)儀器有發(fā)芽箱、發(fā)芽盒（透光）、恒溫箱（20、30、35 ℃）、培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀、解剖針、標(biāo)簽紙、濾紙、量筒、燒杯、容量瓶（100 mL）、棕色瓶、體式顯微鏡（Leica Microsystems Ltd.）等。試驗(yàn)藥品有四唑（2，3，5-tripheny tetrazolium chloride）粉劑，由日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社（Tokyo Chemical Industry，TCI）生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)芽試驗(yàn)對(duì)供試京茄218茄子種子經(jīng)凈度分析后，隨機(jī)選取每重復(fù)100粒種子，4次重復(fù)，在發(fā)芽箱內(nèi)（20 ℃、16 h 黑暗；30 ℃、8 h光照）進(jìn)行紙上發(fā)芽試驗(yàn)，7 d初數(shù)，14 d終數(shù)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.2適宜浸種溫度、時(shí)間的探究對(duì)供試種子經(jīng)凈度分析后，每次隨機(jī)數(shù)取100粒種子在20 ℃浸種18 h；30 ℃浸種4 h，取出各組種子同一操作者相同方法人工剝皮，分別計(jì)時(shí)，最終找出最適宜剝皮的一組，其溫度、時(shí)間即為適宜的浸種溫度、時(shí)間（以單位時(shí)間內(nèi)剝皮的種子數(shù)或剝皮一定的種子數(shù)所用的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判別和找出最適宜剝皮的那組），試驗(yàn)設(shè)4次重復(fù)。

1.2.3TTC溶液配制磷酸緩沖液配制[14]：母液Ⅰ，稱(chēng)取9.078 g KH2PO4溶于1 000 mL蒸餾水中；母液Ⅱ，稱(chēng)取9.472 g Na2HPO4或11.876 g Na2HPO4·2H2O溶于1 000 mL蒸餾水中。然后取母液Ⅰ2份和母液Ⅱ3份混合均勻，測(cè)pH值介于6.5～7.5之間，即成緩沖液。在該緩沖液中溶解準(zhǔn)確數(shù)量的四唑鹽類(lèi)，以獲得準(zhǔn)確的濃度。

不同濃度TTC溶液配制[14]：1%濃度的TTC溶液，稱(chēng)取1 g 四唑粉劑溶解于100 mL磷酸緩沖液中即可。0.2%濃度的TTC溶液：量取1份配好的1%濃度的TTC溶液加入4份磷酸緩沖液混合均勻可得。

四唑溶液必須完全淹沒(méi)種子，溶液須貯存在黑暗處或棕色瓶里，不能直接露光，因?yàn)楣饩€(xiàn)可能使四唑鹽類(lèi)還原而降低其濃度，影響染色效果。

1.2.4TTC染色和觀(guān)察鑒定在“1.2.2”節(jié)得出最適宜浸種溫度、時(shí)間的條件下，對(duì)供試種子進(jìn)行預(yù)濕處理。每次隨機(jī)選取100粒預(yù)濕種子迅速剝皮后，分別選用0.2%、1%2種濃度的四唑染色液，在30、35 ℃恒溫條件下染色不同時(shí)間（1、18、36 h），4次重復(fù)。

染色結(jié)束后，觀(guān)察種子染色情況并記錄著色種子數(shù)目，對(duì)染色種子數(shù)超過(guò)50%的處理組合的著色種子進(jìn)行縱切，在體視顯微鏡下觀(guān)察種子切面的染色效果，區(qū)分種子胚各部分的著色情況，并采集圖片，統(tǒng)計(jì)生活力指標(biāo)。種子經(jīng)染色和處理后，進(jìn)行正確的觀(guān)察鑒定十分重要。一般鑒定原則是，凡是胚的主要構(gòu)造及有關(guān)活營(yíng)養(yǎng)組織染成有光澤的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有生活力種子；凡是胚的主要構(gòu)造局部不染色或染成異常的顏色和光澤，并且活營(yíng)養(yǎng)組織不染色部分已超過(guò)1/2，或超過(guò)容許范圍，以及組織軟化的，完全不染色或染成無(wú)光澤的淡紅色或灰白色，且組織已軟化腐爛或異常、蟲(chóng)蛀、損傷的均為無(wú)生活力種子[14]。

2結(jié)果與分析

2.1計(jì)算發(fā)芽率

發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，觀(guān)察統(tǒng)計(jì)4次重復(fù)種子發(fā)芽的數(shù)目分別為94、96、93、95粒，計(jì)算發(fā)芽率，

發(fā)芽率=（94+96+93+95）/400×100%=95%。

2.2適宜浸種溫度、時(shí)間的確定

在不同浸種溫度、不同浸種時(shí)間條件下，剝皮100粒種子所需時(shí)間如表1所示。

由表1可以看出，當(dāng)溫度一定時(shí)，浸種時(shí)間越長(zhǎng)，剝皮所用的時(shí)間越短，說(shuō)明種皮越容易剝?nèi)ィ划?dāng)浸種時(shí)間相同時(shí)，30 ℃ 浸種剝?nèi)シN皮所需時(shí)間明顯少于20 ℃；當(dāng)浸種溫度為30 ℃時(shí)，浸種4、11、18 h剝?nèi)シN皮所需時(shí)間相差不大，說(shuō)明浸種溫度對(duì)種皮的影響要大于浸種時(shí)間對(duì)種皮的影響。考慮到試驗(yàn)周期等因素的影響，選擇20 ℃、18 h和 30 ℃、4 h為適宜的浸種溫度和時(shí)間組合。

2.3TTC法測(cè)定京茄218茄子種子生活力

不同浸種溫度、時(shí)間組合，不同的染色液濃度、染色溫度、染色時(shí)間條件下，京茄218茄子種子染色情況如表2所示。

從表2中各處理組合著色種子數(shù)目及方差分析結(jié)果可以看出，當(dāng)染色時(shí)間為1 h（見(jiàn)處理組合1、4、7、10、13、16、19、22），京茄218茄子種子的染色效果很差，多數(shù)種子都沒(méi)有著色，只有少數(shù)種子有輕微的著色。

當(dāng)浸種溫度為20 ℃、浸種時(shí)間為18 h，染色溫度相同（30 ℃）時(shí)，隨染色時(shí)間延長(zhǎng)，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多，且在染色液濃度較低（0.2%）時(shí)，達(dá)到了極顯著性差異；而在染色溫度（35 ℃）較高時(shí)卻發(fā)現(xiàn)，在較高染色液（1%）濃度下，染色時(shí)間為36 h的處理組合12染色效果不及染色時(shí)間為18 h的處理組合11，著色種子數(shù)目反而減少，但沒(méi)有出現(xiàn)極顯著性差異 。對(duì)應(yīng)比較處理組合5、6和處理組合2、3以及處理組合11、12和處理組合8、9可以發(fā)現(xiàn)，在染色溫度相同時(shí)，染色液濃度（1%）較高，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多且達(dá)到了極顯著性差異（處理組合12例外，同處理組合9相比，處理組合12著色種子數(shù)目減少但沒(méi)有出現(xiàn)極顯著性差異）。對(duì)應(yīng)比較處理組合8、9和處理組合2、3以及處理組合11、12和處理組合5、6可以發(fā)現(xiàn)，在染色液濃度相同時(shí)，染色溫度（35 ℃）較高有利于種子著色，著色種子數(shù)目增多（處理組合12和處理組合6著色種子數(shù)目相同），其中在染色液濃度較低（0.2%）時(shí)，達(dá)到了極顯著性差異。

當(dāng)浸種溫度為30 ℃、浸種時(shí)間為4 h，染色溫度（30 ℃）較低時(shí)，隨染色時(shí)間延長(zhǎng)，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多，其中在染色液濃度較低（0.2%）時(shí)，達(dá)到極顯著性差異；而在染色溫度（35 ℃）較高時(shí)卻發(fā)現(xiàn)，在較高染色液（1%）濃度時(shí)，染色時(shí)間為36 h的處理組合24染色效果不及染色時(shí)間為18 h的處理組合23，著色種子數(shù)目減少，且達(dá)到了極顯著性差異。對(duì)應(yīng)比較處理組合17、18和處理組合14、15以及處理組合23、24和處理組合20、21可以發(fā)現(xiàn)，在染色溫度相同時(shí)，染色液濃度（1%）較高，種子染色效果增強(qiáng)，著色種子數(shù)目增多且達(dá)到極顯著性差異（處理組合24例外，同處理組合21相比，處理組合24著色種子數(shù)目減少但沒(méi)有出現(xiàn)極顯著性差異）；對(duì)應(yīng)比較處理組合20、21和處理組合14、15以及處理組合23、24和處理組合17、18可以發(fā)現(xiàn)，在染色液濃度相同時(shí)，染色溫度（35 ℃）較高有利于種子著色，著色種子數(shù)目增多且達(dá)到了極顯著性差異（處理組合24 例外，同處理組合18相比，處理組合24著色種子數(shù)目減少但沒(méi)有出現(xiàn)極顯著性差異）。說(shuō)明在染色液濃度（1%）較高、染色溫度（35 ℃）也較高時(shí)，染色時(shí)間（36 h）過(guò)長(zhǎng)反而不利于種子著色，著色種子數(shù)目有減少的趨勢(shì)，染色效果有所下降。

2.4著色種子縱切，顯微鏡下觀(guān)察種子切面染色效果

試驗(yàn)過(guò)程中因?yàn)樘幚斫M合1、4、7、10、13、16、19、22著色種子數(shù)目沒(méi)有超過(guò)50粒，故沒(méi)有進(jìn)行著色種子縱切在體式顯微鏡下觀(guān)察種子切面的染色效果，其余各處理組合均進(jìn)行了著色種子縱切在體式顯微鏡下觀(guān)察種子切面的染色效果并采集圖像（圖1為有代表性且較為清晰的部分采集圖片）。

處理組合9、11、12、15、23、24所采集的圖片較為清晰。再結(jié)合“2.3”表2中各處理組合著色種子數(shù)目及方差分析結(jié)果，處理組合15、24著色種子數(shù)目分別為（84±4）、（89±1）粒，均沒(méi)有反映出供試材料的實(shí)際生活力情況（見(jiàn)“2.1”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果芽率為95%），故處理組合15、24均不適于京茄218茄子種子的生活力測(cè)定。處理組合9、11、12、23，著色種子數(shù)目分別為（95±1）、（97±2）、（94±2）、（97±1）粒，沒(méi)有出現(xiàn)極顯著性差異且均能反映出供試材料的實(shí)際生活力情況。考慮到染色時(shí)間對(duì)試驗(yàn)周期的影響，處理組合9、12染色時(shí)間均為36 h，處理組合11、23染色時(shí)間均為18 h，故選擇處理組合11、23作為測(cè)定京茄218茄子種子生活力的理想處理組合。

3結(jié)論與討論

由標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)芽率計(jì)算結(jié)果可得供試京茄218茄子種子的發(fā)芽率為95%。染色時(shí)間1 h過(guò)短，不適于京茄218茄子種子的生活力測(cè)定。這很可能是由于染色時(shí)間過(guò)短，活種子呼吸過(guò)程中脫氫酶產(chǎn)生的[H]非常有限，來(lái)不及與四唑染色液充分反應(yīng)造成的。染色液濃度（1%）較高、染色溫度（35 ℃）較高、染色時(shí)間延長(zhǎng)，均有利于京茄218茄子種子的生活力測(cè)定。但在較高的染色液濃度（1%）時(shí)，染色溫度（35 ℃）較高，同時(shí)染色時(shí)間（36 h）過(guò)長(zhǎng)，京茄218茄子種子的染色效果反而出現(xiàn)下降，這可能是因?yàn)榉N子長(zhǎng)時(shí)間處于較高的染色溫度條件下，內(nèi)部某些物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到了破壞，導(dǎo)致種子生活力下降而引起的。通過(guò)“2.4”節(jié)部分的綜合分析，可見(jiàn)處理組合11（浸種溫度20 ℃、浸種時(shí)間18 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時(shí)間18 h）和處理組合23（浸種溫度30 ℃、浸種時(shí)間4 h、染色液濃度1%、染色溫度35 ℃、染色時(shí)間18 h）為較理想的處理組合，為T(mén)TC法快速測(cè)定京茄218茄子種子生活力的適宜方法。試驗(yàn)中普遍存在的問(wèn)題是種子著色深淺程度不均勻，有些種子著色太淺，不能清晰地觀(guān)察種子胚各部分的染色情況；有些種子著色又太深，種子部分甚至全部染成深褐色，也無(wú)法準(zhǔn)確判斷種子胚各部分的生活力情況。這可能與種子本身的生活力強(qiáng)弱程度、染色液濃度及染色時(shí)間等因素有關(guān)。

本試驗(yàn)為探究性試驗(yàn)，得出的結(jié)論是在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各種不同處理組合條件下最為理想的處理組合， 有較強(qiáng)的說(shuō)服力和科學(xué)性。但若想獲得TTC法快速測(cè)定茄子種子生活力更加適宜的方法，需要設(shè)計(jì)更多的不同影響因素之間的處理組合，如增加不同浸種溫度、時(shí)間組合；設(shè)計(jì)更多的染色液濃度梯度；增加更多的不同染色時(shí)間及染色溫度的處理組合，并選用不同的茄子品種等。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳瑛. 實(shí)用中藥種子技術(shù)手冊(cè)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1999.

[2]郭巧生. 藥用植物栽培學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社，2004.

[3]景彥彪. 種子生活力的四唑測(cè)定在質(zhì)檢中的運(yùn)用[J]. 種子科技，2006（2）：57-58.

[4]李植良，黎振興，黃智文，等. 我國(guó)茄子生產(chǎn)和育種現(xiàn)狀及今后育種研究對(duì)策[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（1）：24-26.

[5]張念，王志敏，于曉虎，等. 茄子種質(zhì)資源遺傳多樣性的形態(tài)標(biāo)記分析[J]. 中國(guó)蔬菜，2013（14）：46-52.

[6]徐長(zhǎng)城，肖長(zhǎng)惜. 湖北省茄子產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與展望[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2009（1）：1-2.

[7]馬崇堅(jiān). 不同化學(xué)試劑處理對(duì)茄子種子萌發(fā)的影響[J]. 種子，2005，4（10）：30-31，35.

[8]盛海平，汪為民，劉華開(kāi)，等. 水稻種子生活力四唑測(cè)定值與發(fā)芽率間的相關(guān)性[J]. 種子，2000（2）：30-31.

[9]王輝，馬傳喜，徐風(fēng)，等. 熱處理對(duì)小麥生活力和品質(zhì)的影響[J]. 種子，1999（6）：12-13，16.

[10]王麗紅. 幾種常用檢測(cè)玉米種子生活力的方法比較[J]. 種子科技，2012（1）：39-40.

[11]虞華麗，陸新德. 加工番茄種子處理及生活力的測(cè)定[J]. 農(nóng)業(yè)科技與信息，2007（2）：28-29.

[12]曾正明，楊躍華，冉茂林，等. 苦瓜種子生活力四唑測(cè)定值與發(fā)芽率間的相關(guān)性[J]. 綿陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2001（4）：10-11，16.

[13]黃亞軍，楊立武，張國(guó)萍，等. 四唑染色測(cè)定冬瓜種子生活力的研究[J]. 種子，1996（6）：8-9.

[14]International rules for seed testing [S/OL]. [2015-04-01]. http：//www.seedtest.org/en/international-rules-content-1-1083.html.馬俊青，盧紹輝，袁國(guó)軍，等. 利用電導(dǎo)法測(cè)定雀舌黃楊和大葉黃楊的耐寒性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：209-210.