劉麗華++沈衛(wèi)德++李兵

摘要：細胞周期蛋白（cyclin）是調(diào)控真核生物細胞有絲分裂的重要蛋白。以家蠶1～5齡幼蟲的眠蠶和起蠶為材料，采用實時熒光定量PCR方法對家蠶cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在不同齡期幼蟲蛻皮過程中的表達進行研究。結果顯示，1齡幼蟲在眠期、起蠶期幾乎均檢測不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表達，表明此時幼蟲器官發(fā)育基本完成，細胞分裂遲緩。在起蠶期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均隨著幼蟲的發(fā)育進程逐漸增加，表明細胞分裂過程加劇，促進家蠶個體的不斷生長；眠期則沒有規(guī)律性變化。在2～5齡幼蟲中，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均為起蠶期高于眠期，眠期最重要的生理過程是細胞凋亡，因此眠期細胞周期蛋白家族基因表達水平較低，而CyclinB3基因在整個幼蟲時期幾乎不表達。本試驗結果為細胞周期蛋白在家蠶蛻皮變態(tài)發(fā)育過程中的調(diào)控機制研究提供了參考。

關鍵詞：家蠶；細胞周期蛋白；家族基因；幼蟲；表達譜

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0045-02

細胞周期主要受細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴激酶（cyclindependent kinase，CDK）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）在G1/S期和G2/M期2個限制點的調(diào)控[1]。其中，CDK是真核生物細胞周期調(diào)控的關鍵因子，依賴Cyclin發(fā)揮其功能。Cyclin 的表達具有典型的周期性和時相特異性，可作為調(diào)節(jié)亞基與相應的CDK形成復合物，并正調(diào)節(jié)CDK的活性。不同Cyclin在不同時相可通過相應的CDK促進完成細胞周期[2]。

Cyclin廣泛存在于多種生物體內(nèi)[3-4]，在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)20多種細胞周期蛋白家族成員[5]，在家蠶體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)6種。CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1、CyclinH 均是家蠶細胞完成細胞周期必不可少的。有研究表明，CyclinA在S期、G2期到M期的轉變過程中發(fā)揮作用[6]；CyclinB 和CyclinB3同屬于B型周期蛋白，是M期的限制因素[7]；CyclinE是G1期向S期轉變中最重要的周期蛋白[8]；CyclinL1、H可能對細胞周期起調(diào)控作用[9-10]。

家蠶屬于完全變態(tài)發(fā)育昆蟲，一生要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹、成蟲4個形態(tài)和機能完全不同的發(fā)育階段[11]。幼蟲是攝取營養(yǎng)、快速生長的發(fā)育階段，幼蟲期每個齡期之間都要經(jīng)歷眠期和蛻皮的過程，不同發(fā)育階段的細胞均要進行重組和分化，此過程必然受到Cyclin的調(diào)控。采用RT-PCR方法，在家蠶 1～5齡眠蠶和起蠶不同發(fā)育時期，研究直接影響細胞增殖分化的家蠶Cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在蠶體的轉錄特征。本試驗結論為Cyclin在家蠶蛻皮變態(tài)發(fā)育過程中的調(diào)控機制研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1家蠶供試家蠶品種為大造，由蘇州大學蠶桑實驗室保存，于（25±1） ℃、相對濕度60%～75%條件下，用新鮮桑葉飼育。分別取家蠶1～5齡眠蠶、起蠶各10頭，雌雄各半，凍存于液氮中備用。

1.1.2主要試劑總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒、其他化學試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2方法

1.2.1家蠶總RNA提取及cDNA制備按照Trizol試劑盒說明書分別提取家蠶1～5齡眠蠶、起蠶的總RNA，采用紫外分光光度計測定其純度和質量濃度。采用M-MLV反轉錄試劑盒將提取的1～5齡眠蠶、起蠶總RNA分別反轉錄為cDNA。

1.2.2實時熒光定量PCR按照Real-Time PCR的要求，采用Primer 5.0軟件設計Actin3內(nèi)參基因及CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的引物（表1）。以合成的cDNA為模板，采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒對各基因進行實時熒光定量PCR擴增，具體步驟按照試劑盒說明書進行。反應體系為20 μL，反應程序為：95 ℃變性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)。反應過程由ABI 7300型測定儀軟件自動設定，每個樣品重復3次。

1.2.3標準曲線的制作分別將CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、Actin3基因以10倍梯度稀釋為6個質量濃度梯度，進行Real-TimePCR。以所得循環(huán)閾值（CT值）為縱軸，以表1檢測基因與內(nèi)參基因的引物

1.2.4數(shù)據(jù)處理采用ABI 7300型儀器自帶的Sequence Detection Software Version 1.3.1軟件處理RT-PCR的結果數(shù)據(jù)，并參照Schefe的方法[12]進行效率校正。采用SPSS 16.0軟件制作圖表。

2結果與分析

2.1總RNA純度和質量濃度的測定

提取各組織總RNA的D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0，表明所提取總RNA的純度較高，無基因組、蛋白質、其他雜質污染。所提取總RNA的質量濃度為1.1～2.8 μg/μL。

2.2Cyclin家族基因在家蠶幼蟲不同時期的表達

細胞周期蛋白家族基因在家蠶幼蟲各發(fā)育時期的表達情況見圖1。1齡幼蟲在眠期、起蠶期幾乎均檢測不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表達。在起蠶期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均隨著幼蟲的發(fā)育進程逐漸增加，4齡起蠶達到最大值，5齡時稍有下降；眠期則沒有規(guī)律性變化。在2～5齡，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均為起蠶期高于眠期，而CyclinB3基因在整個幼蟲時期幾乎不表達。

3結論與討論

昆蟲蛻皮是復雜的生理生化過程。已有研究表明，昆蟲蛻皮、變態(tài)發(fā)育過程是在蛻皮激素與保幼激素的協(xié)同調(diào)控下，大量基因按照一定的時間、空間次序被誘導或抑制表達而實現(xiàn)的。從細胞周期蛋白家族基因表達的變化探討蛻皮過程，可促進昆蟲蛻皮分子機制的深入研究。

本研究結果顯示，家蠶幼蟲無論是眠蠶還是起蠶，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在1齡幼蟲幾乎均不表達?？梢姡倚Q由受精卵發(fā)育至1齡幼蟲時，幼蟲器官基本發(fā)育完成，因此細胞分裂遲緩，這與筆者前期試驗中Cyclin家族基因在家蠶胚胎期的表達結果相同。與起蠶期相比，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在眠期的表達量均較低?？赡艿脑驗椋咂诘闹饕砘顒邮峭懭ヅf表皮、形成新表皮，此期維持生命活動所需的營養(yǎng)物質和能量主要由貯藏在脂肪體中的營養(yǎng)物質代謝產(chǎn)生；細胞凋亡是此期最重要的生理過程，因此Cyclin家族基因表達水平較低。在起蠶期，Cyclin家族基因（CyclinB3基因除外）表達水平隨著幼蟲齡期推進持續(xù)增加，表明細胞分裂過程加劇，促進家蠶個體不斷生長；至4齡起蠶達到小高峰，之后稍有下降，家蠶生殖器官在3齡末至4齡初迅速發(fā)育，從而進入成熟期[13]。筆者前期對Cyclin家族基因的定量研究表明，其在生殖細胞中均顯著表達[14]，這可能是導致CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量增加的原因。

CyclinB、CyclinB3基因是家蠶細胞周期M期的限制因素。在本試驗中，CyclinB3基因在眠期和起蠶期幾乎均不表達，表明CyclinB基因在幼蟲蛻皮過程中起主導作用，而CyclinB、CyclinB3基因對細胞周期調(diào)控作用的不同之處有待進一步研究。

參考文獻：

[1]詹啟敏，陳杰. 細胞周期與腫瘤轉化醫(yī)學[J]. 中國腫瘤臨床，2014，41（1）：1-7.

[2]Kirsch T，Nickel J，Sebald W. BMP-2 antagonists e-merge from alterations in the low-affinity binding epitope forreceptor[J]. EMBO，2000，19（12）：3314-3324.

[3]Evans T，Rosenthal E T，Youngblom J，et al. Cyclin：a protein specified bymaternal mRNA in seaurchin eggs that is destroyed ateach cleavage division[J]. Cell，1983，33（2）：389-396.

[4]Lewin B. Driving the cell：M phase kinase，its partners，and substrates[J]. Cell，1990，61（5）：743-752.

[5]韓世愈，王嬌. 細胞周期蛋白在惡性腫瘤中的表達及其在腫瘤治療中的作用[J]. 分子診斷與治療雜志，2013，5（5）：357-360.

[6]Shigeo H，Masamitsu Y. Kinase independent activty of Cdc2/CyclinA prevnts the S phase in the Drosophila cell cycle[J]. Genes Cells，1999，4：111-122.

[7]潘敏慧，洪開麗，陳向云，等. BmCyclin B和BmCyclin B3是家蠶細胞周期進程所必需的[J]. 中國科學：生命科學，2013，43（3）：240-246.

[8]劉麗華，沈衛(wèi)德，李兵，等. siRNA-CyclinE對家蠶細胞增殖的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2013，41（4）：21-25.

[9]范蘭芬，鐘楊生，林健榮. 家蠶細胞周期蛋白基因BmCcnl1的克隆及表達分析[J]. 昆蟲學報，2010，53（12）：1325-1332.

[10]江艷. BmCycH基因及其在家蠶中表達特性的研究[D]. 杭州：浙江理工大學，2010.

[11]中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所.中國養(yǎng)蠶學[M]. 上海：上?？茖W出版社，1991：228-230.

[12]Schefe J H，Lehmann K E，Buschmann I R，et al. Quantitative real-time RT-PCR data analysis：current concepts and the novel “gene expressions C-T difference{”} formula[J]. Journal of Molecular Medicine-JMM，2006，84（11）：901-910.

[13]向仲懷，黃君霆，夏建國. 蠶絲生物學[D]. 北京：中國林業(yè)出版社，2005：12-14.

[14]劉麗華，沈衛(wèi)德，李兵，等. 家蠶細胞周期蛋白家族基因在5齡幼蟲組織中的表達譜分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2012，40（11）：13-17.龔麗，李云霞. 一種新型ATP-依賴型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因的克隆、表達和酶學特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44（5）：47-50.