漫曉丹++孟春花++王慧利

摘要：SLA-DRB1是影響豬體免疫反應(yīng)、疾病感染和疫苗應(yīng)答的重要因子。本研究對豬SLA-DRB1基因外顯子3序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，篩選多態(tài)性位點(diǎn)，分析其與PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒）易感性的相關(guān)性。測序發(fā)現(xiàn)SLA-DRB1基因外顯子3存在4個單堿基突變（g.17G/A、g.95C/T、g.137G/C和g.232G/C）。針對g.232G/C建立PCR-RFLP方法，檢測6個豬種群共227個樣本，發(fā)現(xiàn)在大白姜曲海雜交豬、姜曲海豬、長白豬、定遠(yuǎn)豬和杜洛克豬中有GG（0.43，0.80，0.59，0.54，0.83）和GC（0.57，0.20，0.41，0.46，0.17）2種基因型，其他群體均為GG 型。不同基因型豬肺泡巨噬細(xì)胞中PRRSV拷貝數(shù)在接毒后6、12、18、24、36 h差異均不顯著（P>0.05），不同基因型豬血液中病毒載量在接毒后4、7、11、14、21、28、35、42 d差異均不顯著（P>0.05），不同基因型對豬體質(zhì)量和日增質(zhì)量的影響不顯著（P>0.05）。提示SLA-DRB1的g.232G/C突變與 PRRSV抗性無顯著關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；SLA-DRB1基因；外顯子；PCR-RFLP；易感性；堿基突變

中圖分類號： S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0041-04

收稿日期：2015-04-08

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種高度傳染性疾病，以母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病為特征，造成懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和仔豬的高死亡率等[1]。其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（ PRRSV）具有高度變異性、抗體依賴性復(fù)制增強(qiáng)、巨噬細(xì)胞嗜性和持續(xù)性感染等特征[2]，導(dǎo)致現(xiàn)有的疫苗不能很好地控制PRRS的流行，PRRS的防治仍然是養(yǎng)豬業(yè)頭等難題之一[3-4]。因此，豬對PRRSV的抗性也日益受到關(guān)注。國外已有多個課題組分別在體內(nèi)外研究了PRRSV在不同豬種肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中復(fù)制和生長的特征，發(fā)現(xiàn)豬對PRRSV抗性或易感性存在品種（系）間的遺傳差異[5]。Murtaugh 等研究了豬對PRRSV的免疫應(yīng)答，指出疾病的嚴(yán)重性在豬品種間和群體間存在變異[6]。Ait-Ali等的研究表明PRRSV在來源于長白豬的PAM中的復(fù)制相對于其他商業(yè)遺傳品系包括大白豬、皮特蘭和另外2個合成系顯著延遲、緩慢，然而，關(guān)于豬PRRSV抗性的遺傳機(jī)制尚不清楚[7]。

豬的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）即豬白細(xì)胞抗原（SLA），它是由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因位點(diǎn)所組成的染色體上的一個遺傳區(qū)域，其基因產(chǎn)物為MHC抗原，主要功能是抗原遞呈，與動物的抗病性有著密切的關(guān)系[8]。SLA按其抗原結(jié)構(gòu)和功能主要分為3大類，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類，SLA-DRB1屬于Ⅱ類分子。目前，國內(nèi)外對SLA-DRB1基因的研究主要集中在第二外顯子多態(tài)性的研究上。張冬杰等通過對 SLA-DRB1 基因整個編碼區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變大多集中在第二外顯子處，其他3個外顯子突變較少[9]。徐如海等研究表明，SLA-DRB1近端調(diào)控區(qū)存在24個多態(tài)位點(diǎn)，其中 G-146T 位點(diǎn)與仔豬大腸桿菌K88ab黏附表型存在顯著的關(guān)聯(lián)[10]。

Arceo等對200頭雜交豬進(jìn)行PRRSV攻毒時發(fā)現(xiàn)，高病毒載量低體質(zhì)量增加組相對于低病毒載量低體質(zhì)量增加組SLA-DRB1基因表達(dá)量降低，提示SLA-DRB1可能在豬抗PRRSV過程中發(fā)揮重要作用[11]，但SLA-DRB1基因多態(tài)性與豬PRRSV抗性是否關(guān)聯(lián)還未見報道。本研究對2個外來豬種、3 個地方豬種和1 個雜交豬種群SLA-DRB1基因的外顯子3進(jìn)行測序，尋找多態(tài)性位點(diǎn)，同時分析其與PRRSV易感性的相關(guān)性，以期檢測到與PRRSV易感性相關(guān)的分子標(biāo)記，為PRRSV抗性育種提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗豬包括6個品種（或群體），共227頭，其中大白姜曲海豬115頭（江蘇姜曲海種豬場）、姜曲海豬10頭（江蘇姜曲海種豬場）、長白豬37頭（杭州大關(guān)豬場）、大白豬24頭（杭州大關(guān)豬場）、定遠(yuǎn)豬11頭（安徽省定遠(yuǎn)縣豬場）、杜洛克豬30頭（杭州大關(guān)豬場），每個個體取耳組織于凍存管中，置于-80 ℃中保存。PRRSV- NJGC株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。

1.2方法

1.2.1組織樣 DNA 提取耳組織樣的DNA提取采用酚/氯仿抽提法，然后于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SLA-DRB1基因外顯子3擴(kuò)增參照豬SLA-DRB1基因外顯子序列設(shè)計引物DRB-g3，由上海捷瑞公司合成，引物信息見表1。表1引物序列、復(fù)性溫度及產(chǎn)物大小

引物名稱 引物序列（5′→3′） GenBank

登錄號 復(fù)性溫度

（℃） 產(chǎn)物大小

（bp）DRB-g3 F：CAAGGCTCATGGCACTAACT；R：GGCATCGGTGTTTGGAGA NC_010449.4 57 659Pvu Ⅱ-SNP F：GCCCACAGTGACGGTGTAT；R：GCTGAAGGACAGGAGAACAGG NC_010449.4 56 403β-actin F：TCGCCCAACAAAACCAGT；R：TTACCCTCCCTGAATCTGACA AY550069 56 127PRRSV-N F：CCAAAGCCAACCGTGAGAA；R：CCAGAGGCGTACAGGGACA EF534357 56 207

PCR反應(yīng)總體系20 μL，其中含DNA模板（100 ng/μL）2 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，最終加滅菌蒸餾水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3多態(tài)位點(diǎn)測序篩選不同品種每5頭豬 DNA 等量混合構(gòu)建DNA 池，構(gòu)建6個不同的DNA池，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳純化后的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.4PCR-RFLP分析根據(jù)測序結(jié)果選擇外顯子3的232 bp 處的多態(tài)位點(diǎn)，建立PCR-RFLP檢測方法，引物 PvuⅡ-SNP 序列見表1。PCR反應(yīng)總體系20 μL，其中含DNA模板（100 ng/μL）為2 μL，2×Power Taq PCR MasterMix為10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，最終加滅菌蒸餾水至20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，檢測擴(kuò)增結(jié)果。用PvuⅡ酶對引物 PvuⅡ-SNP 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為 20 μL，含PCR產(chǎn)物6 μL，PvuⅡ（10 U/μL）1 μL，10 × buffer G 2 μL，滅菌蒸餾水11 μL；37 ℃ 條件下酶切3～5 h。2.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，溴化乙錠（EB）染色，培清 JS-780全自動凝膠成像分析儀拍照分析。

1.2.5豬PRRSV易感性測定PRRSV易感性的體外測定采用PAM模型，參照 Ait-Ali 等的方法[7]進(jìn)行。簡要步驟如下：分離豬肺泡巨噬細(xì)胞，接種PRRSV病毒，分別在接毒后6、12、18、24、36 h收集細(xì)胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對β-actin基因、PRRSV毒株N基因序列分別設(shè)計特異性引物β-actin和 PRRSV-N （表1，由上海捷瑞公司合成） 。以各PAM細(xì)胞的cDNA為模板PCR擴(kuò)增基因片段，克隆至T載體，以此為模板，SYBR Green Ⅰ染料法進(jìn)行定量PCR（ ABI 7500），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以PRRSV-N基因的拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)的比值作為易感性的參數(shù)。每組3個重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq （2×） 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ROX 0.4 μL，模板 2.0 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時收集熒光信號。

PRRSV易感性的體內(nèi)測定（115頭大白姜曲海豬）參照文獻(xiàn)[11]的方法。簡述如下：25日齡大白姜曲海豬背部肌肉注射法接種PRRSV病毒，分別在接毒后0、4、7、10、14、21、28、35、42 d采血，全血樣本提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR檢測PRRSV-N基因的拷貝數(shù)與β-actin基因拷貝數(shù)的比值，作為易感性的參數(shù)。

1.2.6數(shù)據(jù)分析豬不同基因型與PRRSV易感性及體質(zhì)量和日增質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析采用SPSS 17.0軟件的Independent-Samples t Test，各指標(biāo)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1SLA-DRB1基因外顯子3的擴(kuò)增及測序篩選SNP

對豬SLA-DRB1基因外顯子3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶為659 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。測序分析顯示，在SLA-DRB1基因外顯子3的17 bp處出現(xiàn)1個G/A單堿基突變，95 bp處出現(xiàn)1個C/T單堿基突變，137 bp 處出現(xiàn)1個G/C單堿基突變，232 bp處出現(xiàn)1個G/C單堿基突變（圖2）。經(jīng)分析，外顯子3的232 bp G/C突變處于Pvu Ⅱ 酶切位點(diǎn)識別區(qū)，而其他3個堿基突變處無合適的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，因此選擇232 bp處的G/C突變進(jìn)一步研究。

2.2PCR-RFLP 分析

針對外顯子3的232 bp處G/C 單堿基突變設(shè)計特異性引物，命名為Pvu Ⅱ- SNP。對豬DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為403 bp（圖3），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3SLA-DRB1基因群體遺傳學(xué)分析

在所檢測的各豬種群227個樣本中SLA-DRB1基因外顯子3的232位點(diǎn)處G/C突變只檢測到GG和GC 2種基因型，除大白姜曲海豬群體以外均以GG型居多，GC型次之，G等位基因占優(yōu)勢（表2）。

2.4不同基因型豬群體的PRRSV易感性

比較SLA-DRB1基因外顯子3的232bp突變處不同基因型豬PAM接種PRRSV后不同時間點(diǎn)PRRSV拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)GG 型與GC型差異均不顯著（P>0.05）（表3）；比較不同基因型豬血液中PRRSV載量，發(fā)現(xiàn)在接種PRRSV后不同天數(shù)GG 型與GC型差異均不顯著（P>0.05）（表4）。

2.5不同基因型豬接種PRRSV后體質(zhì)量及日增質(zhì)量的變化

對SLA-DRB1基因外顯子3的232 bp突變不同基因型共115頭大白姜曲海豬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)接種PRRSV后不同天數(shù)的體質(zhì)量和日增質(zhì)量差異均不顯著（P>0. 05） （表5）。

3討論與結(jié)論

主要組織相容性復(fù)合物（MHC）是由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座所組成的染色體上的一個遺傳區(qū)域[12]。它起著編碼移植抗原、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、控制免疫球蛋白和補(bǔ)體的生成以及協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞各亞群的作用，與動物的抗病性有著緊密的關(guān)聯(lián)[13]。Penn等通過對小鼠的MHC研究發(fā)現(xiàn)，MHC的雜合型個體對病原體的抵抗和環(huán)境適應(yīng)性都比純合型強(qiáng)[14]。賈斌等在對新疆多浪羊和中國美利奴羊的MHC-DRBl 第二外顯子進(jìn)行PCR-RFLP多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)了與包蟲病抗性和易感性相關(guān)的等位基因及基因型[15]。余智勇等研究多浪羊MHC-DRB1基因的多態(tài)性時發(fā)現(xiàn)，該基因雜合型個體較多，而純合型個體相對較少[16]，這可能是多浪羊?qū)Νh(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的一個原因。

SLA基因是影響豬體免疫反應(yīng)、疾病感染和疫苗應(yīng)答反應(yīng)的重要因素[17]。國內(nèi)外對MHC-DRB1基因的研究多集中在其第二外顯子多態(tài)性，有關(guān)該基因第三外顯子多態(tài)性與豬抗病力的關(guān)聯(lián)研究未見報道。Nielsen等研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染后豬外周血中表達(dá)SLA Ⅱ類分子的免疫細(xì)胞數(shù)量增加[18]。談永松等的研究表明，SLA-DRB1基因第二外顯子Rsa Ⅰ酶切后可得到4種等位基因條帶：141/93/11 bp、111/69/54/11 bp、180/54/11 bp、93/48/39/54/11 bp，分別標(biāo)記為A、B、C、D。其中五指山豬分出2種帶型：AA、BB；二花臉豬分出3種帶型：AA、BB和AB；皮特蘭豬分出3種帶型：AA、CC和BD[19]。楊彤彤等采用同樣方法對大約克豬、二花臉豬的SLA-DRB1基因外顯子2進(jìn)行了分型，發(fā)現(xiàn)在這2個豬種中僅存在A、B、D 等位基因[20]。徐如海等的研究表明SLA-DRB1基因外顯子2中位點(diǎn)29、149、170對0～28日齡仔豬血清IgG含量有顯著影響[10]。

本研究針對大白姜曲海雜交豬及5個不同品種豬 SLA-DRB1 基因外顯子3第232 bp處G/C突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)僅存在GC和GG 2種基因型，且除大白姜曲海雜交豬群體以外均以GG型居多，GC型次之，G等位基因是優(yōu)勢基因。體內(nèi)外模型分析顯示，SLA-DRB1基因外顯子3第232 bp處G/C突變不同基因型間PRRSV拷貝數(shù)差異不顯著，體質(zhì)量及日增質(zhì)量亦不顯著，說明該SNP位點(diǎn)可能不是影響PRRSV抗性的位點(diǎn)，g.17G/A、g.95C/T、g.137G/C位點(diǎn)與PRRSV的抗性是否關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究。

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