魏彥輝++周榮艷++張軍杰

摘要：為了研究c-KIT在不同毛色山羊皮膚組織中的表達(dá)與定位并探索c-KIT在毛色形成中的作用機(jī)制，以黑山羊、白山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析其相對(duì)表達(dá)量，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行c-KIT表達(dá)定位分析。結(jié)果表明，在山羊皮膚組織中，c-KIT主要分布在皮膚上皮部、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部以及內(nèi)外根鞘。c-KIT在黑山羊、白山羊毛色皮膚組織中表達(dá)部位、表達(dá)水平無(wú)顯著差異，表明c-KIT的表達(dá)量、表達(dá)部位不是造成黑山羊、白山羊色差異的主要因素。

關(guān)鍵詞：c-KIT；山羊；免疫組織化學(xué)；皮膚；毛色

中圖分類號(hào)：S827.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0038-03

絨、毛及裘皮是山羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀，毛色表型特征的選育尤其受到各國(guó)育種人員的關(guān)注[1]。探索山羊毛色形成的機(jī)制可以為培育天然的彩色山羊提供理論基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物的毛色表型特征主要是由毛發(fā)中黑色素的類型、數(shù)量決定的。c-KIT 編碼的蛋白表達(dá)于黑素細(xì)胞前體物，肥大/干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體（mast/stem cell growth factor receptor，c-KIT）屬于跨膜酪氨酸激酶受體，參與黑素細(xì)胞形成、成熟、增殖、分化及遷移等過(guò)程[2-4]。經(jīng)過(guò)伊馬替尼處理的人表皮黑素細(xì)胞中，由于c-KIT不能被磷酸化，從而可以抑制黑素細(xì)胞的遷移[5]。張巧靈等通過(guò)免疫組化分析得到Kit蛋白，在白色羊駝皮膚毛囊內(nèi)根鞘、外根鞘及其結(jié)締組織中有一定量的表達(dá)，但其在黃色羊駝表皮下層的結(jié)締組織中只有很少量的表達(dá)[6]。Kit在白色羊駝中顯著表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量是棕色羊駝的4.602 9倍[7]。但是關(guān)于c-KIT在山羊皮膚組織內(nèi)的表達(dá)及其是否與山羊毛色的形成有關(guān)未見報(bào)道。本試驗(yàn)以黑色山羊、白色山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，首次對(duì)c-KIT在不同毛色山羊皮膚組織中的表達(dá)定位進(jìn)行了研究，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)其在不同毛色山羊皮膚組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，探索該基因與山羊毛色形成的關(guān)系，旨在為研究c-KIT調(diào)控山羊毛色形成的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

在河北省定州市隨機(jī)挑選成年白色山羊、黑色山羊各3只，選取體側(cè)部位皮膚，用刮毛器刮凈羊毛，用手術(shù)法取 1 cm2 左右皮膚組織6塊。將用于總RNA提取的3塊皮膚快速投入液氮中保存，將用于免疫組織化學(xué)分析研究的3塊皮膚投入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后制成組織切片。

1.2主要試劑和儀器

兔抗人c-KIT抗體（購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology INC公司）；封閉用山羊血清工作液、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、Streptavidin-HRP工作液、DAB顯色試劑盒（均購(gòu)自康為世紀(jì)公司）；蘇木素（Solarbio公司）；RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；熒光定量試劑盒（日本東洋紡公司）；其他常規(guī)試劑均使用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。PCR儀（德國(guó)Biometra公司）；iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）；核酸蛋白測(cè)定儀ND2000 （Thermo公司）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）。

1.3總RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄合成

取凍存的山羊皮膚組織，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，利用核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行濃度與純度測(cè)定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈合成，配制模板RNA 10 μL、oligo（dT）18 5 μL、RNase free ddH2O 15 μL的混合液；70 ℃保溫 10 min，冰上急冷2 min。短暫離心后分別加入10 μL 5×M-MLV Buffer、2.5 μL 10 mmol/L dNTP Mixture、1.25 μL Recombinant Ribonuclease Inhibitor、1.25 μL Reverse Transcriptase M-MLV和5 μL RNase free ddH2O。42 ℃保溫1 h，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4山羊皮膚組織中c-KIT的qRT-PCR

1.4.1反轉(zhuǎn)錄合成c-KIT的cDNA根據(jù)山羊c-KIT的基因序列以及GADPH的基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由華大六合基因公司合成。引物序列如下：c-KIT基因正引物：5′-GGCCCACCCTGGTCATTACAGAATAT-3′，反引物：5′-TGTCTGCCGCCTTGGTTGGTAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為225 bp；GADPH基因正引物：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，反引物：5′-CAGTGGTCATAAGTCCCTCC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為107 bp。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，包含cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，2x Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后用 1%瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)和回收純化，連接pEASY-T3載體并轉(zhuǎn)化trans1-t1感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性重組子后送北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序，確定為陽(yáng)性的克隆提取質(zhì)粒。

1.4.2測(cè)定c-KIT基因表達(dá)量取反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，每個(gè)cDNA分別使用的引物對(duì)c-KIT與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。優(yōu)化后的反應(yīng)體系：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，總計(jì)20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 45 s；95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后以溶解曲線來(lái)判定反應(yīng)的特異性。

1.4.3數(shù)據(jù)分析利用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中基因的表達(dá)量結(jié)果經(jīng)內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)量校正。分別擴(kuò)增SCF、GAPDH基因，通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算SCF基因在不同毛色山羊皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)水平，ΔCT目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT黑色山羊-ΔCT白色山羊，SCF基因mRNA表達(dá)差別倍數(shù)以2-ΔΔCT表示。

1.5山羊皮膚組織中c-KIT的免疫組化分析

將固定在10%甲醛溶液的皮膚組織取出，經(jīng)過(guò)脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，獲得厚度為5 μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫甲醇溶液處理 20 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；用PBS清洗3次，每次 5 min。0.1%胰蛋白酶抗原修復(fù)；室溫下用山羊血清封閉 20 min，去掉封閉液，滴加一抗（1 ∶80稀釋），4 ℃孵育16 h，37 ℃復(fù)溫20 min，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照；PBS清洗后滴加二抗（生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG），室溫孵育30 min；PBS清洗后加入Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育20 min；PBS清洗后滴加DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍攝。

2結(jié)果與分析

2.1山羊皮膚組織中總RNA的提取

將所提取的皮膚組織總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳條帶清晰，28 S、18 S清晰可見（圖1）。用核酸測(cè)定儀進(jìn)行RNA樣品測(cè)定，D260 nm與D280 nm比值為1.8～2.0。

2.2山羊皮膚組織中c-KIT的qRT-PCR

2.2.1實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)經(jīng)過(guò)PCR條件優(yōu)化，成功擴(kuò)增了與預(yù)期大小一致的片段，電泳檢測(cè)顯示條帶清晰整齊，擴(kuò)增結(jié)果良好。對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒按10倍倍比稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，由圖2、圖3可以看出c-KIT、GADPH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物CT值均一，熔解曲線只有1個(gè)明顯的峰，表明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，熒光信號(hào)均來(lái)自于特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，且沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)自動(dòng)生成起始模板濃度與CT值間的回歸曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)靈敏度為109～105個(gè)模板。c-KIT基因的回歸方程為y=40.108-3.275x，r2=0.992；GADPH基因的回歸方程為y=45.351-3.276x，r2 =0.998。由此可見，所建立的回歸方程可以用于實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)。

2.2.2實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT相對(duì)定量方法的結(jié)果，表明c-KIT基因在黑色山羊皮膚中的mRNA表達(dá)水平是白色山羊的1.28倍，且差異不顯著。

2.3山羊皮膚組織中c-KIT的免疫組化結(jié)果

山羊皮膚組織中c-KIT的免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示，在白色山羊、黑色山羊皮膚組織中，c-KIT主要定位在細(xì)胞膜上，在皮膚上皮、毛囊漏斗部、外根鞘、內(nèi)根鞘、皮脂腺以及汗腺有陽(yáng)性著色，對(duì)照組無(wú)著色。對(duì)不同毛色山羊皮膚組織中的陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度進(jìn)行測(cè)定比較，結(jié)果表明，c-KIT 在白色山羊、黑色山羊皮膚組織中陽(yáng)性細(xì)胞（毛囊漏斗部、外根鞘、內(nèi)根鞘）的表達(dá)量不存在顯著差異。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，c-KIT在不同毛色山羊皮膚組織中主要分布于表皮、毛囊內(nèi)外根鞘、毛囊漏斗部、皮脂腺、汗腺中，并且黑色山羊、白色山羊皮膚組織中c-KIT的表達(dá)部位、表達(dá)量無(wú)顯著差異。c-KIT表達(dá)于黑素細(xì)胞前體物，作為肥大/干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（mast/stem cell growth factor receptor，c-KIT），屬于跨膜酪氨酸激酶受體，參與黑素細(xì)胞的形成、成熟、增殖、分化及遷移等過(guò)程[2-4]，在物種毛色形成中起重要作用。在正常人皮膚中，c-KIT表達(dá)于表皮、毛囊漏斗部、外根鞘。在羊駝皮膚中，c-KIT主要在毛囊永久部檢測(cè)到信號(hào)[8]。c-KIT在山羊皮膚中主要表達(dá)于上皮、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部、內(nèi)外根鞘，這與在其他物種中的報(bào)道相符，這提示c-KIT在山羊毛色形成過(guò)程中可能與在其他物種中所起的功能相似或相同。c-KIT在黑色山羊、白色山羊皮膚組織中的表達(dá)部位相同，而且其mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異，說(shuō)明c-KIT在皮膚組織中的表達(dá)并不是導(dǎo)致試驗(yàn)所選不同山羊毛色差異的主要因素。人角蛋白細(xì)胞和黑素細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)紫外線誘導(dǎo)后，皮膚中c-KIT及其膜結(jié)合型的SCF配體的表達(dá)量顯著升高[9]，表明在SCF/c-KIT系統(tǒng)中，表皮黑色素著色過(guò)程起到調(diào)節(jié)作用，c-KIT在黑山羊、白山羊表皮中均有明顯表達(dá)，但觀察到的黑色素?cái)?shù)量卻差異顯著，所以推測(cè)不同黑山羊、白山羊皮膚中還存在其他關(guān)鍵因素影響山羊表皮中黑色素的生成。在山羊皮膚組織中，c-KIT主要分布于表皮、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部、內(nèi)外根鞘的上皮細(xì)胞、毛球部的黑素細(xì)胞以及肥大細(xì)胞中。皮膚上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂潛力，能夠分化為具有間充質(zhì)特性的細(xì)胞來(lái)修復(fù)組織損傷[10-11]。因此有學(xué)者認(rèn)為，與KIT有關(guān)系的肥大細(xì)胞，部分種類的造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、黑素細(xì)胞以及胃腸道的卡哈爾氏間質(zhì)細(xì)胞在特定條件下都具有較強(qiáng)的分裂能力[12-13]。因此c-KIT主要表達(dá)于具有較強(qiáng)分裂增殖潛力的細(xì)胞中，c-KIT還可能與皮膚細(xì)胞的更新有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]常洪. 山羊的毛色遺傳[J]. 國(guó)外畜牧科技，1995，22（5）：23-26.

[2]Botchkareva N V，Khlgatian M，Longley B J，et al. SCF/c-kit signaling is required for cyclic regeneration of the hair pigmentation[J]. FASEB Journal，2001，15（3）：645-658.

[3]Parichy D M，Rawls J F，Pratt S J，et al. Zebrafish sparse corresponds to an orthologue of c-kit and is required for the morphogenesis of a subpopulation of melanocytes，but is not essential for hematopoiesis or primordial germ cell development[J]. Development，1999，126（15）：3425-3436.

[4]Nishikawa S，Kusakabe M，Yoshinaga K，et al. In utero manipulation of coat color formation by a monoclonal anti-c-kit antibody：two distinct waves of c-kit-dependency during melanocyte development[J]. EMBO Journal，1991，10（8）：2111-2118.

[5]Xia J X，Li F Q，Urabe K，et al. Imatinib inhibits migration of normal human epidermal melanocytes and suppress the phosphorylation of C-kit[J]. Bangladesh Journal of Pharmacology，2012，7（2）：100-103.

[6]張巧靈，姜俊兵，張維軍，等. 顯性白毛調(diào)控基因在不同毛色羊駝皮膚中表達(dá)差異的研究[J]. 激光生物學(xué)報(bào)，2008，17（4）：491-495.

[7]張丹麗，田雪，宋云飛，等. miR-193b及其靶基因Kit在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（5）：44-49.

[8]姜俊兵，于秀菊，田雪，等. 干細(xì)胞因子及其受體c-KIT對(duì)羊駝毛囊黑色素細(xì)胞增殖與分化的影響及其機(jī)制[J]. 解剖學(xué)報(bào)，2011，42（1）：99-103.

[9]Hachiya A，Kobayashi A，Ohuchi A，et al. The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation[J]. Journal of Investigative Dermatology，2001，116（4）：578-586.

[10]Snippert H J，Haegebarth A，Kasper M，et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin[J]. Science，2010，327：1385-1389.

[11]Thiery J P，Acloque H，Huang R Y，et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell，2009，139（5）：871-890.

[12]Zhu Y I，F(xiàn)itzpatrick J E. Expression of c-kit （CD117） in Spitz nevus and malignant melanoma [J]. J Cutan Pathol，2006，33：33-37.

[13]Tryqqvason G，Hilmarsdottir B，Gunnarsson G H，et al. Tyrosine kinase mutations in gastrointestinal stromal tumors in a nation-wide study in Iceland[J]. APMIS，2010，118（9）：648-656.漫曉丹，孟春花，王慧利，等. 豬SLA-DRB1基因外顯子3單核苷酸多態(tài)性及其與PRRSV易感性的關(guān)聯(lián)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：41-44.