崔恩忠　唐安?！∝暋±凇B　王曙東

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院,南京,210002)

?

HPLC法測定健腎丸中腺苷的含量

崔恩忠唐安福貢磊湯淏王曙東

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院,南京,210002)

摘要目的:建立健腎丸中腺苷含量的測定方法,為提高該制劑的質(zhì)量標準提供研究依據(jù)。方法:采用高效液相色譜法,流動相:乙腈-水(6∶94);色譜柱:Agilent TC-C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速為1.0 mL/min,檢測波長為260 nm,柱溫為25 ℃;進樣量:10 μL。結(jié)果:腺苷在1.25～20.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率為101.04%,相對標準偏差(RSD)為1.93%。結(jié)論:該方法簡便、可靠、重現(xiàn)性好,可用于健腎丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞健腎丸;腺苷;高效液相色譜法

健腎丸為南京軍區(qū)總醫(yī)院全軍腎臟病研究所研制的中藥復方制劑,處方由發(fā)酵蟲草菌粉、黃芪、防風等組成,有補肺益腎,固表止汗之功,用于防治各種慢性腎小球腎炎、腎病綜合征,病程日久至肺衛(wèi)不固、腎氣虧虛易于感冒者。該臨床使用數(shù)十年,有確切療效。目前該制劑的質(zhì)量標準僅采用TLC法對黃芪、防風和發(fā)酵冬蟲夏草菌粉3味藥進行薄層色譜鑒別,無定量檢測指標,無法全面有效的控制其質(zhì)量[1]。為進一步提升其質(zhì)量標準,本文建立了健腎丸中腺苷HPLC含量測定方法。

1資料與方法

1.1一般資料高效液相色譜儀Waters 1525,2487紫外檢測器;FA1104-電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司);KQ-500DE型超聲機(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))。腺苷對照品(110879-200202)購自中國藥品生物制品檢定所;處方藥材均購自南京醫(yī)藥有限公司;健腎丸為南京總醫(yī)院制劑科生產(chǎn),批號為140524、140609、140623、140706、140731。甲醇和乙腈:色譜純(美國默克);水:自制純化水;其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗高效液相色譜儀Waters 1525(雙泵),2487紫外檢測器;色譜柱:Agilent TC-C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:A∶B=6∶94(A:乙腈,B:水);檢測波長為260 nm;柱溫為25 ℃;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL。

1.2.2溶液的制備對照品儲備液的制備:精密稱取腺苷對照品0.5 mg,置25 mL量瓶中,加50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。供試品溶液的制備:取本品粉末約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇50 mL,稱定重量,超聲提取0.5 h,冷卻至室溫,再稱定重量,用50%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液。陰性對照溶液的制備:按處方比例及生產(chǎn)工藝制備缺發(fā)酵冬蟲夏草菌粉、黃芪和防風的陰性樣品,按“2.1.2項”下方法制備。

1.2.3線性關(guān)系考察分別精密腺苷儲備液0.625，1.25，2.5，5.0，10.0 mL至10 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,按“2.1.1”項下方法進行測定,以對照品濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),進行線性回歸,計算回歸方程。

1.2.4精密度試驗精密吸取“2.1.2”項下的腺苷對照品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,以峰面積計算相對標準偏差(RSD)。

1.2.5穩(wěn)定性試驗取同一批號的樣品,按“2.1.1”項下樣品溶液測定方法進行測定,在常溫下分別于0、1、2、4、8 h進樣,記錄腺苷峰面積,以峰面積計算相對標準偏差(RSD)。

1.2.6重復性試驗取同一批號下的樣品5份,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,進行測定,以測定結(jié)果計算相對標準偏差(RSD)。

1.2.7加樣回收率試驗精密稱取腺苷對照品1.4 mg,置50 mL容量瓶中,加75%甲醇至刻度,搖勻,即得對照品儲備液。精密稱取已知含量的樣品0.1 g(腺苷含量為1.4 mg/g),共9份,分別置于250 mL錐形瓶中,分別精密加入腺苷對照品3 mL,5 mL和7 mL,按“2.1.2”項下樣品制備方法即得。精密吸取上述供試液各10 μL注入色譜儀,測定含量,計算回收率。

圖1　健腎丸HPLC圖譜

2結(jié)果

2.1方法專屬性試驗供試品色譜中,在與對照品色譜相應的保留時間處,有同一色譜峰,而陰性對照溶液在相應保留時間處則無峰出現(xiàn),表明其對樣品測定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2腺苷線性關(guān)系試驗按1.2.3項下方法進行測定,以對照品濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),進行線性回歸,得到回歸方程:Y=30561X+4205,r=0.999 5(n=5)。結(jié)果顯示,腺苷的濃度在1.25～20 μg/mL之間,與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見表1、圖2。

表1　腺苷線性關(guān)系考察結(jié)果

圖2　腺苷的標準曲線

2.3精密度試驗以1.2.4項下方法進行測定,計算腺苷峰面積的RSD為0.31%。結(jié)果顯示該方法的精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗以1.2.5項下方法進行測定,計算腺苷峰面積的RSD為0.88%。表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5重復性試驗以1.2.6項下方法進行測定,結(jié)果樣品中腺苷含量RSD為2.20%。說明該方法重復性良好。

表2　腺苷加樣回收率試驗結(jié)果

2.6加樣回收率試驗以1.2.7項下方法進行測定,計算平均回收率為101.04%,RSD=1.93%。見表2。

2.7樣品測定取5批健腎丸(批號為140524、140609、140623、140706、140731),按1.2.2項下制備供試品溶液,按上述色譜條件測定樣品,以外標法計算樣品中腺苷的含量。見表3。

表3　腺苷含量測定結(jié)果

3討論

3.1最大吸收波長的選擇參照《中國藥典》2015版一部百令膠囊中腺苷的含量測定方法[2],選擇最大吸收波長為260 nm。

3.2流動相的選擇參照《中國藥典》2015版一部百令膠囊和金水寶膠囊中腺苷的含量測定方法及其他相關(guān)文獻[2-9],進行了選擇試用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當流動相(乙腈-水)比例為6∶94時,腺苷出峰時間及分離度等條件都較好,故選其為最佳流動相。

3.3腺苷提取條件的選擇通過參考相關(guān)文獻[2-10],實驗對腺苷提取時間(20 min、30 min、40 min)及溶劑用量(50倍、100倍、150倍)分別進行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時間在30 min時腺苷含量最高,提取溶劑用量在100倍和150倍時,腺苷提取率無明顯差別,但均高于50倍用量,故最終確定腺苷提取條件選擇加入100倍溶劑超聲處理30 min,結(jié)果顯示腺苷提取效果較好。

3.4指標成分的選擇冬蟲夏草作為傳統(tǒng)名貴中藥,具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、降血壓血脂、平喘祛痰、治療高血糖癥、肝臟疾病及改善腎功能等作用[11-12],由于藥材資源緊張,現(xiàn)大多采用人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體,以滿足藥材市場。本實驗研究的健腎丸由發(fā)酵冬蟲夏草菌粉、黃芪、防風、白術(shù)和甘草共5味中藥組成,處方分析后認為發(fā)酵冬蟲夏草菌粉為方中君藥,其主要含核苷類如腺苷等[4-5]成分,可能為補益中藥的共有物質(zhì)基礎(chǔ)[13],現(xiàn)代藥理學研究表明[11-12]核苷酸及核苷能促進腸道的正常發(fā)育、成熟和修復,對維持機體正常免疫功能和肝臟正常功能有重要意義。經(jīng)查閱文獻[14]并通過實驗研究,發(fā)現(xiàn)方中臣藥黃芪和防風亦含有腺苷,故增加了健腎丸中總腺苷指標成分的含量測定。其他指標成分后期繼續(xù)進行考察,以不斷提高制劑質(zhì)量標準。

本實驗利用高效液相色譜法測定健腎丸中腺苷的含量,所測結(jié)果重復性、精密度較好,適用于本品的質(zhì)量控制,同時進一步提高了該制劑的質(zhì)量標準。

參考文獻

[1]王曙東,盛華,崔恩忠,等.清腎丸定性定量研究[J].中南藥學,2014,12(7):674-677.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:832.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:1073.

[4]陳志遠,貢濤,丁康,等.UPLC-MS/MS同時測定蛹蟲草中6種成分的含量[J]中國實驗方劑學,2015,21(21):43-46.

[5]梅雪艷,李媛媛,沈于蘭.冬蟲夏草、蟲草菌絲體及蛹蟲草中核苷類成分的測定[J].藥學與臨床研究,2015,23(1):27-29.

[6]席桂同.高效液相色譜法測定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量[J].世界中醫(yī)藥，2014,9(7):934-936,940.

[7]吳春敏,葉榕平.HPLC法測定冬蟲夏草中腺苷含量[J].中草藥,1999,30(9):658.

[8]范志華,湯衛(wèi)華,林霖.HPLC法測定冬蟲夏草發(fā)酵菌絲粉中腺苷的含量[J].現(xiàn)代食品科技,2007,23(7):94-97.

[9]劉少靜,劉銀,張根,等.RP-HPLC定量分析人工北蟲草中3種核苷類有效成分[J].食品研究與開發(fā),2015,36(4):127-129.

[10]徐梅.RP-HPLC法同時測定復方雙花口服液中6種活性成分[J]中成藥,2015,37(7):1482-1486.

[11]Pagratis N C,Bell C,Chang Y F,et al.Potent2—amino-,and 2-fluoro-2-dexyribonucleotide RNA inhibitors of keratinocyle growth factor [J].Nat Biotechnol,1997,15(1):68-73.

[12]King DJ,Ventura DA,Brasier AR,et al.Novel combinatorial selection of phosphorothioate oligonucleotide aptamers[J].Biochemistry,1998,37(47):16489-16493.

[13]張元杰,錢正明,陳肖家,等.HPLC法同時測定補益中藥中尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量[J].藥物分析雜志,2010,30(1):33-36.

[14]姜艷艷,劉斌,石任兵,等.防風化學成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[J].藥學學報,2007,42(5):505-510.

(2015-07-07收稿責任編輯：王明)

HPLC Determination of Adenosine in Jianshen Pill

Cui Enzhong,Tang Anfu,Gong Lei,Tang Hao,Wang Shudong

(NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,China)

AbstractObjective:To provide scientific proof for promoting quality standard of Jianshen Pill by determining the level of adenosine in it.Methods:HPLC(High Performance Liquid Chromatography) method was used with Agilent TC-C18(2) column ( 250 mm×4.6 mm,5 μm ) and a mobile phase of Acetonitrile-Water (6∶94).Flow rate was 1.0 mL/min,column temperature was 25 ℃.The detection wavelength was 260nm and sample loop volume 10 μl.Results:The calibration curve linear within the range of 1.25～20.00 μg /mL of acetonitrile,and the average recovery was 101.04% (RSD=1.93%).Conclusion:The method is simple,accurate and repeatable,which can be used for the quality control of Jianshen Pill.

Key WordsJianshen Pill; Acetonitrile; HPLC

基金項目:全軍醫(yī)療機構(gòu)制劑質(zhì)量標準提升專項課題重點項目(編號:13ZJZ13)——“腎病系列非標準制劑質(zhì)量標準提升的研究”

作者簡介:崔恩忠(1981.09—),男,學士,藥師,研究方向:中藥制劑工藝研究,E-mail:cez_life@163.com 通信作者:湯淏(1980.05—),男,碩士,主管藥師,研究方向:中藥制劑新技術(shù)研究,E-mail:tang_hao0518@sina.com

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.042