王　萍　王宇鶴　賀新懷　辛愛潔　劉亞倩

(1 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046； 2 西藏民族大學(xué)，咸陽，712082)

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中藥研究

不同純化方法對丹參水提取液中丹酚酸B的含量影響

王萍1王宇鶴2賀新懷1辛愛潔1劉亞倩1

(1 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046； 2 西藏民族大學(xué)，咸陽，712082)

摘要目的：考察不同純化方法對丹參水提液中丹酚酸B含量的影響，以優(yōu)選出丹參水提取液的最佳純化方法。方法：以丹酚酸B含量和浸膏得率為考察指標(biāo)，對乙醇沉淀法、高速離心法和大孔樹脂吸附法3種純化方法進行了比較。結(jié)果：大孔樹脂吸附法處理后所得到的丹酚酸B的含量最高，浸膏得率最低；乙醇沉淀法處理后丹酚酸B的含量最低，浸膏得率居中；高速離心法處理后丹酚酸B的含量居中，但浸膏得率最高。結(jié)論：大孔樹脂吸附法為丹參水提液的最佳純化方法。

關(guān)鍵詞丹參；丹酚酸B；乙醇沉淀法；高速離心法；大孔樹脂吸附法

丹參為唇形科植物鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖，味苦、性微寒，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、清心除煩之效[1]，為臨床上治療“血瘀”癥的常用藥物。丹參水提液中有效成分主要是酚酸類物質(zhì)，包括丹酚酸A、B、C以及原兒茶醛等，其中丹酚酸B是丹參水溶性代表成分之一，且其含量最高[2-5]，故其含量的高低直接影響著丹參水提液質(zhì)量的好壞，從而影響著丹參制劑的質(zhì)量。本文以丹參水提液中丹酚酸B含量和浸膏得率為指標(biāo)，比較了乙醇沉淀法、高速離心法和大孔樹脂吸附法三種方法對水提液中丹酚酸B成分的純化效果，為丹參水提液的純化工藝提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器Alliance e2695型高效液相色譜儀(美國waters公司，Empower色譜工作站)；電子天平(MSA125P-1CE-DU,德國賽多利斯)；高速臺式離心機(TGL-10C，上海安亭)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠)；真空干燥箱(DZF-6050，常州市衡正電子儀器有限公司)。

1.2試劑丹參藥材(購自陜西康勝堂藥業(yè)有限公司，批號：094Q140301)；丹酚酸B對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：111562-201212)；AB-8大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純(購自南京化學(xué)試劑股份有限公司)。

2方法

2.1提取與純化

2.1.1提取工藝取丹參700 g，加水浸泡30 min，煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至每毫升含1 g原生藥的藥液，備用。

2.1.2純化工藝為了保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每個試驗方法平行制備4份樣品溶液。

2.1.2.1乙醇沉淀法取水提液200 mL，平均分成4份，每份50 mL，加乙醇至藥液醇濃度為65%，靜置，冷藏過夜，抽濾，回收乙醇并真空干燥成干浸膏，粉碎后備用。

2.1.2.2高速離心法取水提液200 mL，平均分成4份，每份50 mL，置高速離心機中，10000 r/min離心15 min，濾過，濾液濃縮并真空干燥成干浸膏，粉碎后備用。

2.1.2.3大孔樹脂吸附法取水提液200 mL，平均分成4份，每份50 mL，加1%鹽酸溶液調(diào)pH值至3，靜置，離心，取離心液上樹脂柱(生藥量∶樹脂量=2∶1)。待藥液流完后，加入1倍生藥量超純水沖洗樹脂柱，待超純水流凈后，用4倍量60%乙醇，以1BV/h流速進行洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮并真空干燥成干浸膏，粉碎后備用。

2.2丹酚酸B的含量測定

2.2.1色譜條件根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》及有關(guān)文獻[6-9]確定丹酚酸B含量測定的色譜條件：色譜柱為SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為286 nm，柱溫為室溫，進樣量10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取丹酚酸B對照品4.0 mg，加適量75%甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，作為對照品溶液(0.16 mg/mL)。

2.2.3供試品溶液的制備本品粉末(過三號篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人75%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜(0.2 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。各色譜圖見圖1。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對照品溶液2 μL、6 μL、10 μL、14 μL、18 μL、20 μL進樣，記錄色譜圖，測定峰面積。以進樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。結(jié)果丹酚酸B在0.32～3.2(μg)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=844519X-28250，R2=0.9999(n=6)。

2.2.5精密度試驗精密吸取丹酚酸B對照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定丹酚酸B的峰面積值，結(jié)果RSD為0.34%，說明儀器的精密性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗精密吸取對照品溶液于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h各進樣10 μL，對照品溶液中丹酚酸B的峰面積值的RSD為0.65%，表明在10 h內(nèi)對照品溶液穩(wěn)定。

圖1　丹參對照品、樣品HPLC色譜圖

注：A.對照品溶液，B.樣品。

2.2.7加樣回收率試驗稱取浸膏細粉(過三號篩)共6份，每份約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入一定量已知濃度的丹酚酸B對照品溶液，按照2.3.3方法制備供試品溶液，照上述高效液相色譜條件測定。見表1。

表1　丹酚酸B加樣回收率

2.2.8樣品的測定精密吸取各供試品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.2 μm)濾過，取續(xù)濾液10 μL進樣，測定丹酚酸B含量。

2.3浸膏得率的測定精密吸取提取液20 mL，置干燥值恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，于105 ℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定重量，計算浸膏得率。結(jié)果見表2。計算公式如下：(W1為浸膏重量，V為樣品溶液的體積，W2為藥材重量)。

3結(jié)果

對丹參水提液不同純化方法處理所得丹酚酸B含量和浸膏得率進行了測定。見表2。

表2　不同純化方法的丹酚酸B含量和浸膏得率±s)

由表2可知大孔樹脂吸附法處理后所得到的丹酚酸B的含量最高，浸膏得率最低；乙醇沉淀法處理后丹酚酸B的含量最低，浸膏得率居中；高速離心法處理后丹酚酸B的含量居中，但浸膏得率最高。對以上3組丹酚酸B含量數(shù)據(jù)進行方差分析，用以說明各組之間是否有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3　方差分析表

注：F(3,8)0.05=4.07，F(xiàn)(3,8)0.01=7.59。

從方差分析的結(jié)果可知，3種純化方法丹酚酸B含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但表3尚未表明3種純化方法兩兩方法之間的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，因此，我們采取兩兩間多重比較(q檢驗法)對丹酚酸B含量測定結(jié)果進行了統(tǒng)計學(xué)處理。見表4。

表4　三種純化方法兩兩比較表

由表4可知，水提醇沉法與高速離心法的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，高速離心法與大孔樹脂吸附法差異有統(tǒng)計學(xué)意義，水提醇沉法與大孔樹脂吸附法差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中以大孔樹脂吸附法純化丹參水提液所得到的丹酚酸B含量最高，與其他方法差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4討論

中藥水提液中往往所含的化學(xué)成分較多，采用單一指標(biāo)對中藥制劑的制備工藝與質(zhì)量進行評價具有較大的局限，故本次實驗中采用雙指標(biāo)進行考察，確保優(yōu)選的純化工藝條件的合理性。

在實驗過程中，我們查閱文獻，發(fā)現(xiàn)在近5年的文獻資料中采用高速離心法對丹酚酸B進行純化工藝的文獻報道較少，選擇大孔樹脂吸附法對丹酚酸B進行純化工藝的文獻報道較多，故而在純化方法選擇時，將傳統(tǒng)的乙醇沉淀法、高速離心法和大孔樹脂吸附法作為本次實驗純化方法，并對結(jié)合參考文獻[10-14]，對乙醇沉淀法和高速離心法采用正交試驗確定了各自工藝的最佳參數(shù)，同時次對大孔樹脂吸附法進行考察，篩選了純化丹酚酸B的大孔吸附樹脂，優(yōu)選了大孔吸附樹脂純化丹酚酸B的工藝條件，確定該法的工藝參數(shù)。

乙醇沉淀法雖為水提液中常用的純化方法之一，醇沉后有效成分含量最低，可能是醇沉?xí)r選用的醇沉濃度較高，造成溶液的極性變小，有效成分的溶解度變小而沉淀，影響丹參的藥效；高速離心法對丹參水提液的處理操作方法較為簡單，有效成分的損失也不大，但浸膏得率最高，可能是因為離心機的轉(zhuǎn)速不夠，沒有將水提取液中的大分子雜質(zhì)去除完全；大孔樹脂吸附法雖操作過于麻煩，工藝復(fù)雜，但有效成分保留率較高，且出膏率大幅度降低，為降低服用量的較好方法。

丹參是常用活血化瘀中藥之一，水溶性成分主要為酚酸類成分，本次實驗僅僅是通過對比實驗，考察了純化方法對丹酚酸B含量的影響，而對丹參水溶性其余成分含量變化的影響還需進一步研究。

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(2015-10-11收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effects of Different Purification Methods on Content of Salvianolic Acid B in Water Extract from Salvia Miltiorrhiza Bge

Wang Ping1, Wang Yuhe2, He Xinhuai1, Xin Aijie1, Liu Yaqian1

(1ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang712046,China;2TibetUniversityforNationalities,Xianyang712082,China)

AbstractObjective: To explore the best purification method by observing effects of different purification ways on the extractive rate of salvianolic acid B in Salvia Miltiorrhiza Bge water-extraction. Methods: Salvianolic acid B content and dry extract yield rate were used as indexes for assessing the best purification method among ethanol precipitation, high speed centrifugation and macroporous resin absorption. Results: Among all three methods, salvianolic acid B content by macroporous absorption resin was the highest, with dry extract yield rate being the lowest; salvianolic acid B content by ethanol precipitation was the lowest, with dry extract yield rate being the medium level; and salvianolic acid B content by high speed centrifugation was at the medium level, with dry extract yield rate being the highest. Conclusion: Water extraction of Salvia miltiorrhiza Bge by macroporous absorption resin is considered as the best purification method.

Key WordsSalvia Miltiorrhiza Bge; Salvianolic Acid B; Ethanol precipitation; High speed centrifugation; Macroporous absorption resin

基金項目：陜西省中醫(yī)藥管理局科研項目(編號：13-zy024)；陜西省教育廳科研項目(編號：14JK2017)

作者簡介：王萍(1977.12—)，女，碩士研究生，講師，主要研究方向：中藥藥物制劑研究，E-mail:964908494@qq.com 通信作者：劉亞倩(1984.12—)，女，碩士研究生，實驗師，主要研究方向：藥劑學(xué)，E-mail：492860562@qq.com

中圖分類號：R284.2

文獻標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.039