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(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腦一科,沈陽,110034; 2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽,110032)

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川芎赤芍干預(yù)腦缺血再灌注大鼠血管新生的實驗研究

馬進(jìn)1甘雨1袁媛1黃赫1喬鐵2崔英海1劉曼玉2褚麗2田淼淼2

(1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腦一科,沈陽,110034; 2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽,110032)

摘要目的:觀察川芎赤芍對大鼠腦梗死再灌注后血管生成素-1(Ang-1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)的影響。方法:線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型,將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、川芎赤芍低、高劑量組、銀杏葉片組。ELISA法測定大鼠血清Ang-1,實時熒光定量PCR方法檢測缺血腦組織HIF-1a mRNA表達(dá)。結(jié)果:大鼠血清Ang-1測定:給藥3 d、7 d、14 d模型組與空白組相比升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給藥3 d、7 d、14 d模型組與川芎赤芍低劑量組、高劑量組、銀杏葉組相比水平低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);實時熒光定量PCR檢測HIF-1a mRNA:給藥3 d、7 d、14 d模型組與空白組相比表達(dá)升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給藥3 d、7 d、14 d模型組與川芎赤芍低劑量組、高劑量組、銀杏葉組相比表達(dá)水平低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:川芎赤芍可升高缺血再灌注大鼠血清中Ang-1的水平及缺血腦組織中HIF-1a mRNA的表達(dá),提示川芎赤芍治療腦梗死機(jī)制可能與促進(jìn)血管新生有關(guān)。

關(guān)鍵詞腦缺血再灌注;血管新生;Ang-1;HIF-1a

腦梗死(Cerebral Infarction,CI)是指由于腦部血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致腦組織發(fā)生缺血缺氧性變性或死亡,出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能受損表現(xiàn)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]如果能盡快促進(jìn)缺血區(qū)的血管新生,增加新的側(cè)枝循環(huán),恢復(fù)局部血流,不僅可以阻止這些可逆性損傷的神經(jīng)元進(jìn)一步加重出現(xiàn)不可逆變性,而且可以為神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重塑性創(chuàng)造良好的微環(huán)境,有利于神經(jīng)功能的恢復(fù),改善患者預(yù)后。川芎、赤芍是傳統(tǒng)名方經(jīng)常一起使用的藥對,具有行氣活血化瘀功效。本研究探討兩藥配伍應(yīng)用對大鼠腦缺血再灌注血管新生的影響,并與銀杏葉片進(jìn)行比較分析。

1材料與方法

1.1實驗材料選用健康雄性SD大鼠120只,體重240～260 g,購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司(許可證編號:SYXK(遼)2012-0003)。川芎和赤芍,購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,中藥陽性對照藥銀杏葉片:安徽圣鷹藥業(yè)有限公司,批號:150806。血管生成素-Ⅰ(Ang1)ELISA試劑盒(北京誠林生物科技有限公司,批號:E-30570)。羅氏cDNA合成試劑盒04896866001 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(100 units);03358941001組織勻漿儀用鑼蓋管;03542394001 MagNa Pure LC RNA Isolation Kit-High Performance羅氏全自動核酸純化試劑盒(RNA提取)。

1.2分組與給藥方法健康雄性SD大鼠,每組24只。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為:1)空白組:正常大鼠不手術(shù);2)模型組:參照文獻(xiàn)采用線栓法制備大腦中動脈局灶性腦缺血模型;3)川芎赤芍低劑量組;4)川芎赤芍高劑量組;5)銀杏葉片組。銀杏葉片配制成濃度為0.027片/mL。各組大鼠于3 d、7 d、14 d進(jìn)行取材,每次取材各組8只大鼠,進(jìn)行ELISA法測定大鼠血清Ang-1(血管生成素),實時熒光定量PCR方法檢測大鼠缺血腦組織HIF-1a mRNA。

1.3主要儀器MCAO栓線(280～350 g):北京西濃科技有限公司,型號:2838-A4。羅氏MPLC2.0全自動核酸提取系統(tǒng),羅氏LC480實時熒光定量PCR儀,羅氏組織勻漿儀。TD5A-WS低速臺式離心機(jī):長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱:廈門醫(yī)療電子儀器廠,出廠編號:82062。ThermoScientificMultiskan FC酶標(biāo)儀:北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.4模型制備采用線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型[3]:SD大鼠腹腔注3%水合氯醛麻醉后,仰臥固定于手術(shù)臺,頸部正中切開,暴露出右側(cè)頸總動脈,分離出頸內(nèi)、外動脈,在頸內(nèi)外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈,右側(cè)頸總動脈處剪口,插入頭端圓鈍直徑為0.28 mm的MCAO栓線,進(jìn)栓線長度約18～19 mm,在大腦中動脈起始端線栓大鼠大腦中動脈,然后將頸總動脈連同栓線一起結(jié)扎。栓塞2 h后取出MCAO栓線。動物清醒2 h后參照Zea Longa[4]的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評分,分值在1～3分者入組。0分:無神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圏;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失。神經(jīng)功能評分分?jǐn)?shù)越高,神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重,反之亦然。未到時間點死亡等不足動物隨機(jī)替補(bǔ)。

1.5實驗方法1)分別于給藥第3天、7天、14天處死各組大鼠。處置方法:3%水合氯醛腹腔麻醉,腹主動脈取靜脈血,取血5 mL/次,全血在室溫中靜置30 min左右,然后以3 000 r/m離心10 min,取血清放入-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。取血后將各組大鼠斷頭處死,取出右側(cè)缺血腦組織,置-80 ℃冰箱進(jìn)行凍存。2)ELISA法測定大鼠血清血管生成素(Ang-1)。用實時熒光定量PCR方法檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)。

2結(jié)果

2.1ELISA法大鼠血清血管生成素(Ang-1)測定給藥3 d、7 d、14 d模型組與空白組、相比升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給藥3 d、7 d、14 d模型組與低劑量組、高劑量組、銀杏葉組相比水平低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示川芎、赤芍對腦神經(jīng)功能缺失有治療作用,可能是通過調(diào)節(jié)與血管新生有關(guān)因子的變化,促進(jìn)了神經(jīng)功能修復(fù)。見表1。

表1　各組血清中ANG-1的含量變化情況

注:和模型組比較:*P<0.05。

圖1　給藥3 d各組缺血腦組織中HIF-1a mRNA

圖2　給藥7 d各組缺血腦組織中HIF-1a mRNA

2.2實時熒光定量PCR檢測HIF-1a mRNA給藥3 d、7 d、14 d模型組與空白組相比表達(dá)升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);給藥3 d、7 d、14 d低劑量組、高劑量組、銀杏葉組與模型組相比表達(dá)水平高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示川芎、赤芍對腦缺血損傷后HIF-1a mRNA表達(dá)水平有影響,提示川芎、赤芍可能增加血管新生和具有腦保護(hù)作用。見圖1-圖3。

圖3　給藥14 d各組缺血腦組織中HIF-1a mRNA

3討論

缺血性腦血管病遺留的神經(jīng)功能缺損一直是人類醫(yī)學(xué)史上的難題。腦缺血后神經(jīng)元的修復(fù)不僅與生長相關(guān)因子、營養(yǎng)因子表達(dá)等有關(guān),而且還取決于腦缺血區(qū)血管新生的微環(huán)境[5]。血管新生(Angiogenesis,AG)的概念于1993年由Hockel等首先提出。血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、芽生、游走、血管分裂和分支而形成新的毛細(xì)血管網(wǎng),使其功能與局部的需要相適應(yīng)的生物學(xué)過程[6]。血管新生可以影響腦缺血后側(cè)枝循環(huán)的建立,從而為神經(jīng)功能的重塑和神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)創(chuàng)造良好的微環(huán)境。

Ang屬于特異性血管新生作用因子,由Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4組成。Ang-1是目前發(fā)現(xiàn)的一種能夠抵抗血管滲漏的內(nèi)源性蛋白質(zhì)因子,缺血再灌注早期Ang-1表達(dá)升高具有促進(jìn)血管新生作用。它能抵抗炎性以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)引起的血管滲漏,對VEGF促血管新生的功能有促進(jìn)和互補(bǔ)作用,且并不影響血管的正常形態(tài),長期高濃度的Ang-1對健康無明顯不利影響[7]。Meng等[8]研究發(fā)現(xiàn),Ang-1能促進(jìn)大鼠腦缺血后缺血半暗帶內(nèi)內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生。腦缺血損傷過程中,低氧引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷。低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是аβ-異型二聚體,對與血管新生相關(guān)的基因有重要的調(diào)節(jié)作用。缺氧細(xì)胞-低氧誘導(dǎo)因子-血管內(nèi)皮生長因子-血管新生可能是主要的調(diào)節(jié)通路[9]。缺氧細(xì)胞通過激活低氧誘導(dǎo)因子來誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子等基因的表達(dá),通過此來完成受損區(qū)新生血管代償缺血區(qū)血供不足的功能。

近年來,許多學(xué)者對中藥治療腦梗死的作用機(jī)制進(jìn)行了大量的臨床觀察和實驗研究,證實了多種中藥具有抗凝、防止動脈粥樣硬化、改善腦血流、防止缺血性損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,促進(jìn)血管新生等作用,而且均可通過多種途徑發(fā)揮協(xié)同作用共同治療腦梗死。有研究結(jié)果顯示,其中丹參組、川芎組、赤芍組,丹參黃芪組、丹參黃芪組、川芎黃芪組可明顯促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖能力;可見不同的活血化瘀藥和補(bǔ)氣活血藥配伍應(yīng)用對HUVEC的增殖能力具有不同的促進(jìn)作用,這可能是這些藥物在細(xì)胞層面上促進(jìn)血管生成的作用機(jī)制。本研究顯示川芎、赤芍配伍應(yīng)用能夠顯著上調(diào)腦缺血再灌注后ANG-1及HIF-1a mRNA的表達(dá),提示川芎、赤芍治療急性腦梗死可能與參與調(diào)節(jié)促進(jìn)血管新生因子表達(dá)有關(guān),為該藥臨床治療腦梗死提供了理論依據(jù)。

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(2016-03-29收稿責(zé)任編輯：王明)

Study of Sichuan Lovage Rhizome and Red Peony Root on Intervening Angiogenesis of Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

Ma Jin1,Gan yu1,Yuan yuan1,Huang He1,Qiao Tie2,Cui Yinghai1,Liu Manyu2,Chu Li2,Tian Miaomiao2

(1TheSecondHospitalaffiliatedtoLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110034,China;2LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China)

AbstractObjective:To observe the effect of Sichuan Lovage Rhizome and Red Peony Root on angiogenin-1 (Ang-1),ischemia induced factor-1 a (HIF-1 a) on rats with cerebral ischemia-reperfusion.Methods:The model of rat with middle cerebral artery ischemia-reperfusion was established with suture-occluded method.SD rats were randomly divided into control group,model group and Sichuan Lovage Rhizome and Red Peony Root low and high dose groups,Ginkgo group.Ang-1 in rat serum was tested with ELISA method.HIF-1a mRNA expression in ischemia brain tissue was detected with real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (rt-PCR).Results:Ang-1 in rat serum in model groups increased on days 3,7 and 14 compared with the control group (P<0.05).HIF-1a expression with Rt-PCR increased in model groups on day 3,7 and 14 compared with control group (P<0.05).HIF-1a expression in model group on day 3,7 and 14 was lower than Sichuan Lovage Rhizome and Red Peony Root low and high dose groups,Ginkgo group (P<0.05).Conclusion:Sichuan Lovage Rhizome and Red Peony Root could enhance Ang-1 in rats with cerebral ischemia-reperfusion and HIF-1a mRNA expression in ischemic brain tissue,suggesting that the mechanism of Sichuan Lovage Rhizome and Red Peony Root on treating cerebral ischemia may be related with promoting angiogenesis.

Key WordsCerebral ischemia reperfusion; Angiogenesis; Ang-1; HIF-1a

基金項目:遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)計劃項目(編號:L2013362);遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者青藍(lán)工程杰出青年項目

作者簡介:馬進(jìn)(1976.08—),女,醫(yī)學(xué)博士,副主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事中醫(yī)腦病研究，E-mail:majin760702@163.com

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.033