陳思勤　朱克儉　李勇敏　周　堅(jiān)

(湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410006)

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臭牡丹總黃酮抑制小鼠Lewis肺癌實(shí)體瘤及其與p53、bcl-2、bax表達(dá)相關(guān)性研究

陳思勤朱克儉李勇敏周堅(jiān)

(湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410006)

摘要目的：探討臭牡丹總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及其與p53、bcl-2、bax基因表達(dá)的相關(guān)性。方法：取近交系雄性C57BL/6小鼠50只，造模，將造模成功的Lewis肺癌小鼠40只隨機(jī)分成模型組,順鉑組,臭牡丹總黃酮高、低劑量組；另取10只無(wú)瘤小鼠作為空白對(duì)照組。腹腔注射給藥,模型組給予生理鹽水0.01 mL/g,連續(xù)14 d；順鉑組給予順鉑0.4 mg/kg連續(xù)5 d；臭牡丹高、低劑量組分別予臭牡丹總黃酮提取物0.6 g/kg、0.3 g/(kg·d)，連續(xù)14 d。給藥結(jié)束后次日處死小鼠,稱取瘤重，計(jì)算腫瘤抑制率，采用Real-time PCR法檢測(cè)p53、bcl-2及bax mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：1)對(duì)瘤重影響：4組瘤重結(jié)果如下±s)：模型組(4.70+1.29)g、順鉑組(2.24+0.68)g、總黃酮高劑量組(3.26±1.06)g、總黃酮低劑量組(3.99±1.31)g；其中順鉑組、總黃酮高劑量組瘤重低于模型組(P<0.05),并且該2組瘤重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2)腫瘤抑制率：順鉑組：53.4%；臭牡丹總黃酮高劑量組：30.6%,臭牡丹總黃酮低劑量組：15.1%。3)對(duì)基因表達(dá)影響：臭牡丹總黃酮高、低劑量組皆能上調(diào)p53和bax mRNA表達(dá)(高劑量組P<0.01,低劑量組P<0.05)；順鉑組能下調(diào)bcl-2(P<0.05)及上調(diào)bax mRNA表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論：臭牡丹總黃酮能夠改善Lewis肺癌小鼠生存狀況,能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)；并且其抑制腫瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制可能與上調(diào)p53和bax mRNA的表達(dá)以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞臭牡丹；黃酮；Lewis肺癌；Real-Time PCR

臭牡丹(Clerodendrum Bungei Steud)性平，味辛、苦，功能祛風(fēng)除濕、解毒散瘀[1]。作為治療腫瘤的常用中藥，臨床多年來(lái)廣泛用于多種腫瘤尤其是肺部腫瘤的治療，取得了較好的臨床療效[2～5]，為此，筆者采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其總黃酮提取物抗實(shí)體瘤作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1材料

1.1細(xì)胞株及動(dòng)物L(fēng)ewis肺癌細(xì)胞株；近交系C57BL/6雄性小鼠60只，體重(18±2)g，4周周齡。

1.2主要試劑及藥物TRIZOL試劑：Invitrogen；SYBR Green qPCR Mix：TOYOBO；DEPC：Amresco；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Fermentans公司；三氯甲烷：上?；瘜W(xué)試劑公司；異丙醇：上?；瘜W(xué)試劑公司；無(wú)水乙醇：上?；瘜W(xué)試劑公司；順鉑：規(guī)格：10 mg，山東齊魯制藥，批文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20023460，批號(hào)：1110381DB。

臭牡丹總黃酮：由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供臭牡丹生藥，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提取，總黃酮含量65%，1 g相當(dāng)于生藥30 g，批號(hào)：20130720。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1Lewis肺癌模型建立將細(xì)胞濃度已調(diào)整至1×107/mL的Lewis肺癌細(xì)胞懸液搖勻，接種至5只C57BL/6小鼠右側(cè)腋下皮下，每只0.2 mL。14 d待腫瘤充分生長(zhǎng)后(約2.5cm×2.5cm大小)處死小鼠，在超凈工作臺(tái)上完整剝離右側(cè)腋下瘤體，放置于培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌生理鹽水沖洗2遍后用PBS液沖洗2遍，取生長(zhǎng)較好的魚肉樣組織約4 g，放入200目過(guò)濾篩中，加少量PBS液，充分研磨3遍，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×107/mL，使用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板記錄活細(xì)胞數(shù)量(活細(xì)胞數(shù)量須大于95%)，并迅速接種至50只C57BL/6小鼠右側(cè)腋下皮下，每只0.2 mL，造模過(guò)程要求在1 h之內(nèi)完成。

2.2分組及給藥接種腫瘤7 d后，觀察并選擇接種腫瘤成功小鼠40只，隨機(jī)分為模型組，順鉑陽(yáng)性對(duì)照組，臭牡丹高劑量組和臭牡丹低劑量組4組，每組10只，另取正常小鼠10只作為空白對(duì)照組。分組后開(kāi)始腹腔注射給藥，給藥劑量根據(jù)人體表面積折合法計(jì)算。模型組：生理鹽水0.01 mL/g，連續(xù)14 d；順鉑組：順鉑0.4 mg/kg連續(xù)5 d；臭牡丹高劑量組：總黃酮提取物0.6 g/kg(相當(dāng)于成人1日口服量30 g臭牡丹生藥的5倍劑量，用生理鹽水稀釋)，連續(xù)14 d；臭牡丹低劑量組：總黃酮提取物0.6 g/kg(相當(dāng)于成人1日口服劑量30 g臭牡丹生藥的2倍劑量，用生理鹽水稀釋)，連續(xù)14 d。

2.3觀察指標(biāo)與檢測(cè)

2.3.1腫瘤抑制率給藥完畢24 h后處死小鼠，在無(wú)菌操作下，完整剝離腫瘤瘤體，稱取瘤重，腫瘤生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%。

2.3.2Real-time PCR法檢測(cè)腫瘤bcl-2、bax和p53 mRNA的表達(dá)RNA提?。喝∩L(zhǎng)良好的腫瘤組織100 mg入1 mL Trizol試劑，將組織置于冰上充分勻漿，細(xì)胞用移液槍輕輕吹打；將勻漿組織標(biāo)本加入EP管中，劇烈震蕩30 s，靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混勻，室溫靜置5 min；離心：4 ℃，12 000 r/min，15 min；吸去上清液，轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻，放置于4 ℃冰箱10 min；離心：4 ℃，12 000 r/min，10 min；去上清液，留取沉淀，加入1 mL 75%乙醇(預(yù)冷)，震蕩洗滌RNA沉淀；離心：7 500 r/min，5 min；盡量吸去上清液，空氣干燥10 min；加入20 μL的DEPC水溶解。

檢測(cè)RNA的完整性：1.5%瓊脂糖電泳：將瓊脂糖0.45 g+0.5×TBE 30 mL，用微波爐中火沸騰2次，防止揮發(fā)，融化的瓊脂糖常溫冷卻至60 ℃時(shí)加入10 mg/mL溴化乙錠(EB)1.5 μL(含量為0.5 μg/mL)，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30～45 min；電泳槽中加入足量的0.5×TBE，垂直拔除梳子，瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，液面浸過(guò)膠1～2 mm，點(diǎn)樣，取3 μL RNA，1 μL 6×溴酚藍(lán)buffer在透明膠上混勻點(diǎn)樣，開(kāi)啟電源，電壓為100V，電泳時(shí)間15 min，后置于凝膠圖像成像分析儀下掃描，若可見(jiàn)28 s，18 s條帶，表示RNA完整。

消化RNA中的DNA：總體積100 μL(RNA 17 μL、DNase 3 μL、Rnase inhibitor 3 μL、10×PCR Buffer 10 μL、25 mmol/L MgCl233 μL)，步驟如下：37 ℃水浴1 h；加等體積苯酚50 μL和氯仿50 μL抽提一次；4 ℃，12 000 r/min，離心10 min；取上清液，置于小EP管中，加200 μL異丙醇，充分混勻，放置10 min；4 ℃，12 000 r/min，離心10 min；棄上清液，加75%乙醇0.5 mL，充分溶解；4 ℃，7 500 r/min，離心5 min，棄乙醇，室溫干燥10 min，加入20 μL DEPC水，冰上放置30 min，-20 ℃保存。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA合成)：將1 μL Oligo dT(0.5 μg/μL)和5.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，補(bǔ)充DEPC處理水至12 μL；混勻后離心，65 ℃溫浴5 min，立即置于冰上；比例設(shè)置：5×Reaction Buffer 1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、Antisense 1 μL、10 mM dNTPs 10 μL、Reverse Transcriptase 7 μL、Total volume 20 μL(在42 ℃反應(yīng)1 h，后在70 ℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活)混勻，短暫離心；cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Real-Time PCR擴(kuò)增：引物合成與設(shè)計(jì)：參照GenBank上的bax、bcl-2、p53及GAPHD基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)檢測(cè)其特異性。如表1。

表1　引物設(shè)計(jì)表

反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、Sense 1 μL、Antisense 1 μL、2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL、H2O 7 μL、Total 20 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃，3 min一個(gè)循環(huán)，(95 ℃ 15s，62 ℃(p53)、60 ℃(bcl-2)、56 ℃(bax)30 s，PCR儀采集熒光信號(hào))40個(gè)循環(huán)。

數(shù)據(jù)分析：采用2-△△Ct法對(duì)Real-Time PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct給藥組-△Ct對(duì)照組；差別倍數(shù)=2-△△Ct，其中模型組的數(shù)值均為1；2-△△Ct數(shù)值若大于1則說(shuō)明該目的基因較模型組上調(diào)，若小于1則說(shuō)明該目的基因較模型組下調(diào)。

3結(jié)果

3.1臭牡丹總黃酮對(duì)Lewis肺癌實(shí)體瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制作用順鉑組、臭牡丹總黃酮高劑量組瘤體重量均低于模型組(P<0.05)，其中順鉑組較模型組瘤重差異最為明顯(P<0.01)；臭牡丹低劑量瘤重較模型組稍低，但P>0.05；多重比較中臭牡丹總黃酮高劑量瘤重組較順鉑組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.259)，提示兩藥抑制腫瘤效果近似，臭牡丹總黃酮對(duì)Lewis肺癌移植瘤具有明顯抑制作用，其中高劑量組抑瘤率為30.6%。見(jiàn)表2。

3.2臭牡丹總黃酮對(duì)Lewis肺癌小鼠p53、bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響如表3所示，相較模型組，臭牡丹總黃酮高劑量組p53、bax mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且低劑量組p53、bax mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而這2組的bcl-2 mRNA表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(shì)，但P>0.05；順鉑組bax mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)，bcl-2 mRNA表達(dá)水平也明顯下調(diào)，但p53 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)趨勢(shì)不明顯。

表2　各組Lewis肺癌實(shí)體瘤小鼠瘤重及腫瘤抑制率±s)

注：與模型組相比：*P<0.01，**P<0.05。

表3　各組Lewis肺癌小鼠p53、bcl-2、bax mRNA含量

注：與模型組相比*P<0.05，**P<0.01。

4討論

原發(fā)性支氣管肺癌(肺癌)，是目前惡性腫瘤腫瘤死亡的主要原因。其中，非小細(xì)胞肺癌占肺癌總?cè)藬?shù)的75%～80%。2010年美國(guó)的肺癌新發(fā)病例估計(jì)有222 500例，因肺癌死亡的有157 300例[6]。中醫(yī)藥治療是目前中晚期非小細(xì)胞肺癌患者的主要方法之一。與化療相比，中醫(yī)藥治療對(duì)實(shí)體瘤的療效不及化療，但在癥狀改善和中位生存期方面較化療有明顯優(yōu)勢(shì)[7]。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞內(nèi)在的程序性自殺機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞可控制的崩解為凋亡小體，后被周圍細(xì)胞和吞噬細(xì)胞識(shí)別并且吞噬。細(xì)胞凋亡失調(diào)、細(xì)胞凋亡機(jī)制出現(xiàn)異常，則細(xì)胞無(wú)限增殖化而無(wú)法壞死凋亡，導(dǎo)致腫瘤的形成。并且放化療及生物治療等亦能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以達(dá)到治療腫瘤的目的[8]。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因包括：Fas受體與Fas配體、Caspase家族、Apaf-1、bcl-2家族、p53等。bcl-2基因是1985年Tsujimoto等從大多數(shù)濾泡型非霍奇金B(yǎng)淋巴細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的原癌基因，1988年Vaux證實(shí)bcl-2基因高表達(dá)可明顯維持細(xì)胞存活，而不影響細(xì)胞增殖。其高表達(dá)會(huì)抑制放、化療誘導(dǎo)的凋亡；抑制其表達(dá)則可能增加放、化療敏感性[9-10]。bax基因是1993年Oltvai等從表達(dá)bcl-2的人B細(xì)胞系RLT中分離出的蛋白質(zhì)分子，有研究表明[11-12]bax基因表達(dá)下調(diào)或缺失可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，并與腫瘤放化療療效不好相關(guān)。p53基因是定位于17號(hào)染色體短臂(17p13.1)，編碼分子量53kd的和磷酸蛋白。在正常情況下，細(xì)胞中p53的含量很低，在DNA損傷或其他條件的刺激下，細(xì)胞中的p53含量會(huì)增加。當(dāng)p53發(fā)生突變后，則喪失抑癌功能，轉(zhuǎn)為促進(jìn)細(xì)胞惡變的癌基因?，F(xiàn)明確p53是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中的負(fù)調(diào)控因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)，在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中有重要作用[13]。p53為bcl-2和bax的上游調(diào)控基因，可與bcl-2、Bax共同作用完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，野生型p53可下調(diào)bcl-2和上調(diào)bax基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]。

中醫(yī)認(rèn)為，肺癌的病因主要有外邪侵淫、邪毒壅滯、正氣虛弱、臟腑失調(diào)、痰濕內(nèi)結(jié)、瘀毒內(nèi)蘊(yùn)等。痰瘀邪毒內(nèi)結(jié)，氣陰耗傷，肺失宣降為其主要病機(jī)。故臨床多以化瘀祛痰，解毒散結(jié)，益氣養(yǎng)陰為治療原則。歐陽(yáng)锜研究員[15]通過(guò)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)和科研實(shí)踐，所訂制以“解毒抗癌”為主的通用方中，用于肺癌之清肺解毒方即重用臭牡丹以清熱解毒抗癌。潘敏求教授治療肺癌常用之肺復(fù)方中重用臭牡丹，與白花蛇舌草相配伍清熱解毒、散瘀止痛，以抗癌，并獲得了很好的臨床療效[16]。有研究[17-18]對(duì)歐陽(yáng)锜經(jīng)驗(yàn)方“保肺飲”(重用臭牡丹為君藥)進(jìn)行體內(nèi)外的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)觀察中，發(fā)現(xiàn)該方劑對(duì)新鮮肺鱗癌、惡性淋巴瘤組織細(xì)胞具有明顯抑制作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)該方可以明顯減輕三甲基膽蒽誘生大鼠肺癌模型的癌性病變程度、炎癥并發(fā)及體重下降。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，臭牡丹總黃酮能夠抑制Lewis肺癌小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)，改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存狀態(tài)，可能是臭牡丹抗腫瘤有效部位之一。其機(jī)制可能與上調(diào)促細(xì)胞凋亡基因p53和bax mRNA的表達(dá)有關(guān)。該結(jié)果為臭牡丹作為臨床應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)實(shí)依據(jù)。

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(2016-05-25收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Inhibition Effect of Clerodendrum Bungei Flavonoinds on Lewis Rats' Lung Tumor and its Correlation to the Expression of p53,bcl-2,and bax Gene

Chen Siqin,Zhu Kejian,Li Yongmin,Zhou Jian

(AffiliatedHospitalofHuNanAcademyofTraditionalChineseMedicine,Changsha410006,China)

AbstractObjective:To explore the effect of clerodendrum bungei steud flavonoids (CBSF) on mice with Lewis lung cancer and its correlation to the expression of p53,bcl-2,and bax.Methods:To select 50 C57BL/6 male mice,after modelling,choose 40 with Lewis lung cancer and randomly divided them into four groups:model group,DDP group,CBSF high dose group,CBSF low dose group (with 10 in each),and 10 healthy mice into blank group.Drug administration:model group:intraperitoneal injection of physiological saline 0.01 mL/g for 14 days; DDP group:intraperitoneal injection of DDP 0.4 mg/kg for 5 days; CBSF high dose group:intraperitoneal injection of CBSF 0.6 g/kg for 14 days; CBSF low dose group:intraperitoneal injection of CBSF 0.3 g/kg for 14 days.Execute all mice after the medication,then weight up the tumors and calculate the tumor inhibition rate.Besides,using real-time PCR method to detect the expression of p53,bcl-2 and bax.Results:1)The effect on tumor ±s).The tumor weight of four groups are as follow:model group (4.70±1.29)g,DDP group (2.24±0.68)g,CBSF high dose group (3.26±1.06)g,CBSF low dose group (3.99±1.31)g.The tumor weight of DDP group and CBSF high dose group are lighter than that of the model group (P<0.05).Besides,there is no significant difference between these two groups (P>0.05).2)The tumor inhibition rate (IR).The IR of DDP group is 53.4%,CBSF high dose group is 30.6%,and CBSF high dose group is 15.1%.3)The effect on gene expression.Both CBSF groups can up-regulate the expression of p53 mRNA and bax mRNA (P<0.05 or P<0.01); DDP group can down-regulate the expression of bcl-2 mRNA (P<0.05) and up-regulate the expression of bax mRNA (P<0.01).Conclusion:Clerodendrum bungei flavonoids can improve the living quality of Lewis lung cancer mice and inhibit growth of tumor.Its antineoplastic mechanisms might be up-regulation of the expression of p53 mRNA and bax mRNA and induce apotosis of tumor.

Key WordsClerodendrum bungei; Flavonoids; Lewis lung cancer; Real-Time PCR

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81503452)

通信作者：朱克儉(1955.12—)，男,研究員,研究方向:內(nèi)科疑難病證辨治方法,E-mail:0731zkjo@263.net

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.002