趙琳，張敏瑩，徐東坡，周彥鋒，方弟安，段金榮，劉凱

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，江蘇 無(wú)錫214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫214081）

?

2個(gè)地理種群大銀魚(yú)COⅠ基因序列變異與遺傳分化

趙琳1、2，張敏瑩1，徐東坡1，周彥鋒1，方弟安1，段金榮1，劉凱1

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，江蘇 無(wú)錫214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫214081）

摘要：為探究大銀魚(yú)Protosalanx hyalocranius不同地理種群的遺傳變異情況，采用PCR產(chǎn)物純化測(cè)序方法，測(cè)定了太湖、洪澤湖兩個(gè)種群共96尾大銀魚(yú)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基 （cytochrome oxidaseⅠ，COⅠ）基因的部分序列。結(jié)果表明：在638 bp序列中共檢測(cè)到6個(gè)變異位點(diǎn)，占核苷酸總數(shù)的0.94%；A、G、T、C平均含量依次為 26.2%、34.0%、21.3%和 18.5%，A+T含量 （47.5%）低于 G+C含量（52.5%）；共發(fā)現(xiàn)7種單倍型，其中hap1、hap5和hap7為共享單倍型，hap6為洪澤湖種群特有，hap2、hap3和hap4為太湖種群特有，在7種單倍型中，hap1為明顯的優(yōu)勢(shì)單倍體型，共54個(gè)個(gè)體（占總個(gè)體數(shù)的56.25%）；平均單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.642和0.001 48，遺傳多樣性較低；AMOVA分析顯示，種群內(nèi)遺傳變異為79.82%，種群間變異為20.18%，兩種群間遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.201 79，表明兩種群間遺傳分化程度較高。本研究結(jié)果可為合理開(kāi)發(fā)和利用大銀魚(yú)野生資源提供參考。

關(guān)鍵詞：大銀魚(yú)；地理種群；線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基 （COⅠ）；遺傳分化

大銀魚(yú)Protosalanx hyalocranius隸屬于硬骨魚(yú)綱 Osteicthyes、胡瓜魚(yú)目 Osmeriformes、銀魚(yú)科Salangidae、大銀魚(yú)亞科Protosalanginae、大銀魚(yú)屬Protosalanx Regan［1］，主要分布于東海、黃海、渤海海域和長(zhǎng)江、淮河中下游河道及湖泊水庫(kù)，是中國(guó)銀魚(yú)科中分布廣泛、產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)價(jià)值均較高的魚(yú)類(lèi)。大銀魚(yú)是太湖、洪澤湖的傳統(tǒng)名特產(chǎn)之一，也是江蘇省出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)品。目前，關(guān)于大銀魚(yú)的研究主要集中在生物學(xué)特性［2］、移植增殖［3］、種群生態(tài)［4］等方面，而在分子生物學(xué)方面的研究較少［5-8］。

相較于核基因，線粒體基因具有單一的母性遺傳模式、無(wú)內(nèi)含子且重組現(xiàn)象發(fā)生概率低，更適合作為DNA條形碼標(biāo)記［9］。由于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基 （COⅠ）基因的序列進(jìn)化速率較快，密碼子的保守性高而且引物的通用性強(qiáng)［10］，常被認(rèn)為其可以如實(shí)反映物種之間的真實(shí)進(jìn)化關(guān)系，因此，有學(xué)者提出可以利用這一特定基因來(lái)做動(dòng)物DNA條形編碼，并且已確立其在動(dòng)物物種識(shí)別中的作用［11］?；贑OⅠ基因分析，Ward等［12］有效地區(qū)分了澳大利亞207種海洋魚(yú)類(lèi)，Schlei等［13］對(duì)鮭科魚(yú)類(lèi)一個(gè)亞科的3個(gè)屬進(jìn)行了鑒定，王中鐸等［14］鑒別了南海40種硬骨魚(yú)類(lèi)。郭立等［15］研究中所涉及的太湖新銀魚(yú)COⅠ基因多樣性分析為本研究提供了重要啟示。本研究中，測(cè)定了中國(guó)大銀魚(yú)2個(gè)地理種群的COⅠ基因序列，分析其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，以期為保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用大銀魚(yú)種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用太湖大銀魚(yú)采集于2014年5月21日，共247尾，體長(zhǎng)為32～71 mm，體質(zhì)量為0.1～0.7 g；試驗(yàn)用洪澤湖大銀魚(yú)采集于2014年5月23日，共231尾，體長(zhǎng)為31～72 mm，體質(zhì)量為0.1～0.7 g。采樣網(wǎng)具為銀魚(yú)拖網(wǎng) （俗稱(chēng)飛機(jī)網(wǎng)）。樣品采集后立即保存于95%乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2方法

1.2.1DNA提取 參照文獻(xiàn)［16］的方法并略作修改，具體如下。

取0.1 g大銀魚(yú)背部肌肉，剪碎放入1.5 mL

將上述加入冰乙醇的上清液置于冰箱中冷凍1 h后，以13 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀。用70%酒精清洗沉淀1～2次，將離心管倒置，自然晾干，向離心管中加入150 μL ddH2O（或TE）溶解，置于冰箱 （4℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方法參照文獻(xiàn)［17］，其序列為

COI-F：5＇TGTAAAACGACGGCCAGT 3＇，

COI-R：5＇CAGGAAACAGCTATGACAC 3＇。

引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。試驗(yàn)所用試劑購(gòu)自大連寶生物科技有限公司。PCR反應(yīng)體系 （共20 μL）：Premix Taq（TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye）10 μL，正反向引物（20 mmol/L）各l μL，DNA模板 （20 ng/μL）2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。用ABIVeriti 96 well梯度PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性3 min；94℃下變性45 s，55℃下退火45 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后于72℃下再延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為100 bp DNA Ladder Marker。PCR產(chǎn)物回收純化送至上海鉑尚生物有限公司測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。共測(cè)序96尾大銀魚(yú)樣品，其中太湖種群49尾，洪澤湖種群47尾。

1.3數(shù)據(jù)處理

將測(cè)定的序列用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行對(duì)位排列并輔以人工校對(duì)，在NCBI中經(jīng)BLAST比對(duì)；用MEGA 3.1軟件計(jì)算不同序列的堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換與顛換比值 （si/ sv）［18］。用DNASP 5.10軟件包計(jì)算群體的單倍型數(shù) （NH）、單倍型多樣性 （Hd）、核苷酸多態(tài)性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù) （K）［19］。利用Arlequin軟件中的分子變異分析估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布，以及地理種群分化水平 （Fst）［20］。

2　結(jié)果與分析

2.1大銀魚(yú)群體COⅠ基因序列的多樣性

大銀魚(yú)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到清晰的COⅠ電泳條帶，長(zhǎng)度約650 bp（圖1）。

圖1　大銀魚(yú)mtDNA COⅠ基因PCR擴(kuò)增電泳圖 （最右邊通道為100 bp DNA Ladder Marker）Fig.1 PCR amplification electrophoresis of mtDNA COⅠgene of ice fish Protosalanx hyalocranius （The rightmost lane is 100 bp DNA Ladder Marker）

測(cè)序得到的序列經(jīng)人工校對(duì)和比對(duì)去除兩端不確定的序列后，獲得638 bp的序列片段，經(jīng)BLAST同源性分析，與大銀魚(yú)線粒體DNA全序列（No.gb|JN242657.1|）中COⅠ序列的一致性高達(dá)99%，確認(rèn)所測(cè)序列為大銀魚(yú)COⅠ序列的5＇端部分。638 bp序列中，堿基 A、G、T、C的平均含量依次為26.2% （26.0% ～26.5%）、34.0% （33.7% ～34.2%）、21.3%（21.2% ～21.6%）和 18.5%（18.3%～18.7%），A+T含量（47.5%）低于G+C含量 （52.5%），符合硬骨魚(yú)類(lèi)堿基組成特征［21］。

所有樣本638 bp序列中，共檢測(cè)到6個(gè)變異位點(diǎn) （variable sites），分別位于第125、239、248、317、329和557位點(diǎn)上 （表1）。其中第248位為轉(zhuǎn)換位點(diǎn) （transitional paris），其余5個(gè)為顛換位點(diǎn) （transversional pairs）。太湖種群出現(xiàn)6個(gè)變異位點(diǎn)，其中4個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；洪澤湖種群出現(xiàn)3個(gè)變異位點(diǎn)，均為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。總變異位點(diǎn)占核苷酸總數(shù)的0.94%，且全部發(fā)生在三聯(lián)密碼子的第3個(gè)堿基上，而密碼子的前2個(gè)堿基上無(wú)變異，符合線粒體蛋白質(zhì)編碼基因密碼子第3位點(diǎn)進(jìn)化速度最快、第2位點(diǎn)最保守的一般規(guī)律［22］。序列中沒(méi)有插入或缺失的變異位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)個(gè)數(shù)和顛換位點(diǎn)個(gè)數(shù)的比值 （si/sv）為5，大于Li［23］所提出的期望值0.5，表明此片段沒(méi)有飽和，適合進(jìn)行遺傳變異分析。

2.2單倍型分析

96尾大銀魚(yú)樣本共檢出7種單倍型 （表1）。從單倍型分布 （表2）情況分析，太湖種群出現(xiàn)6種單倍型，洪澤湖種群出現(xiàn)4種單倍型。其中hap1為明顯的優(yōu)勢(shì)單倍體型，共54個(gè)樣本，占樣本總數(shù)的56.25%。2個(gè)群體的共享單倍型有3種，分別為 hap1、hap5和 hap7，占樣本總數(shù)的77.08%。除3種共享單倍型外，hap2、hap3和hap4為太湖種群特有，占樣本總數(shù)的 9.38%；hap6為洪澤湖種群特有，占樣本總數(shù)的13.54%。

2.3種群的遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)

遺傳多樣性是指生物種內(nèi)和種間的遺傳變異度［24］。遺傳多樣性通常采用單倍型多樣性 （Hd）與核苷酸多樣性 （Pi）來(lái)度量［25］，Hd和Pi值越大，表明種群的遺傳多樣性越豐富。平均核苷酸差異數(shù) （K）代表了每個(gè)群體內(nèi)兩個(gè)隨機(jī)選取的mtDNA序列間平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸數(shù)目［26］。2個(gè)種群大銀魚(yú)的遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)結(jié)果表明：太湖種群Hd略低于洪澤湖種群，2個(gè)種群的Pi均很低；太湖種群的K=0.680 27，洪澤湖種群的K= 1.000 93；太湖種群的D值為負(fù)值。

表1　大銀魚(yú)兩群體mtDNA COⅠ基因多態(tài)位點(diǎn)及單倍型Tab.1 Polymorphic loci and haplotypes on mtDNA COⅠgene of two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius

表2　大銀魚(yú)兩群體線粒體COⅠ基因單倍型分布Tab.2 Distribution of seven haplotypes on mtDNA COⅠgene in two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius

表3　大銀魚(yú)兩群體內(nèi)的遺傳多樣性及Tajima's D檢驗(yàn)Tab.3 Genetic diversity index and Tajima's D tests of two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius

2.4種群AMOVA分析

將2個(gè)大銀魚(yú)種群歸為一個(gè)組進(jìn)行AMOVA分析 （表4），結(jié)果顯示，種群內(nèi)的遺傳變異系數(shù)為79.82%，種群間的遺傳變異系數(shù)為20.18%，種群間遺傳分化系數(shù)為0.201 79，兩群體間遺傳差異極顯著 （P＜0.01）。

3　討論

表4　大銀魚(yú)兩群體mtDNA COⅠ基因序列AMOVA分析Tab.4 Analysis of molecular variance（AMOVA）on mtDNA COⅠgene of two populations of ice fish Protosalanx hyalocranius

3.1COⅠ基因的應(yīng)用

目前，DNA條形編碼 （DNA barcodes）已成為一種有效的生物鑒定手段，它將完成一些傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定手段無(wú)法完成的工作［27］。COⅠ基因中部分片段能夠用作條形碼，這是因?yàn)镃OⅠ在能保證足夠變異的同時(shí)，又很容易被通用引物擴(kuò)增，且目前研究表明，其DNA序列本身很少存在插入和缺失 （即使存在也主要分布于該基因的3＇端），對(duì)結(jié)果的分析不會(huì)造成很大的影響［28］。同時(shí)，COⅠ基因還擁有蛋白編碼基因所共有的特征，即密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響，可以自由變異。這是因?yàn)樵诘鞍拙幋a基因里，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，其第3位堿基通常均不受自然選擇作用，而是自由變化的［27］。本研究中的變異位點(diǎn)全部發(fā)生在三聯(lián)密碼子的第3個(gè)堿基上，而密碼子的前2個(gè)堿基上沒(méi)有變異，符合上述規(guī)律，也證明了COⅠ基因用作遺傳分析的可行性。

3.2大銀魚(yú)單倍型多樣性和核苷酸多樣性

Bowen等［29］提出了一個(gè)判斷種群是否發(fā)生擴(kuò)張的簡(jiǎn)單方式，即利用單倍型多樣性與核苷酸多樣性來(lái)估計(jì)種群的進(jìn)化歷史，他認(rèn)為單倍型多樣性較高而核苷酸多樣性較低 （Hd＞0.5，Pi＜5%）是因?yàn)槠款i效應(yīng)后種群數(shù)量迅速擴(kuò)張?jiān)斐傻摹伪缎投鄻有暂^高而核苷酸多樣性較低的情況在洄游魚(yú)類(lèi)及部分海水生物中很常見(jiàn)，如刀鱭 （Hd=0.999 3，Pi=0.042 0）、西大西洋斑點(diǎn)魷 （Hd=0.79～0.98，Pi=0.002 9～0.006 8）［28］，在青海湖裸鯉、鱇浪白魚(yú)等淡水魚(yú)類(lèi)中也存在這種情況［30-31］。

本研究中，大銀魚(yú)種群的Hd為0.642，而其Pi僅為0.001 48，可能是由于積累核苷酸多樣性所需要的時(shí)間比積累單倍型多樣性漫長(zhǎng)許多，這說(shuō)明本研究中的大銀魚(yú)種群是從一個(gè)有效種群數(shù)量較小的群體，經(jīng)快速擴(kuò)張而來(lái)。

3.3大銀魚(yú)種群的中性檢驗(yàn)遺傳分化

應(yīng)用Tajima’s D值中性檢驗(yàn)推測(cè)種群曾經(jīng)歷的歷史時(shí)，如果該值為負(fù)值，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到顯著標(biāo)準(zhǔn)，則說(shuō)明序列中含有比中性進(jìn)化模型更多的核苷酸位點(diǎn)變化，可能預(yù)示著被研究種群曾經(jīng)經(jīng)歷過(guò)一個(gè)擴(kuò)張的歷史［32］。本研究中，太湖種群Tajima’s D值為負(fù)值 （表3），表明太湖種群可能曾經(jīng)經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張。若將兩種群看作一個(gè)整體，則D值仍為負(fù)值，說(shuō)明大銀魚(yú)在歷史上發(fā)生過(guò)擴(kuò)張，而研究樣本數(shù)量較小，則有可能是造成各群體在單獨(dú)進(jìn)行中性檢驗(yàn)時(shí)不顯著 （P＞0.05）的原因。

遺傳分化系數(shù)是反映各亞群間遺傳分化的重要指標(biāo)。由種群AMOVA分析可知，太湖與洪澤湖之間的Fst值為0.201 79，表明兩種群間存在極顯著分化。另外，2個(gè)群體間的7種單倍型中，有3種屬于共享單倍型，分別為hap1、hap5和hap7，說(shuō)明這3種單倍型很可能是一種較為穩(wěn)定、能夠適應(yīng)環(huán)境變化的原始單倍型類(lèi)型。

本研究結(jié)果初步揭示了大銀魚(yú)種群經(jīng)歷過(guò)快速擴(kuò)張，太湖種群和洪澤湖種群大銀魚(yú)可能因地理隔離產(chǎn)生了明顯的遺傳分化。

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中圖分類(lèi)號(hào)：Q346；S917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.010

文章編號(hào)：2095-1388（2016）03-0285-05

收稿日期：2015-09-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)運(yùn)行項(xiàng)目 （2015DKA30470-003）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng) （2013JBFM07）

作者簡(jiǎn)介：趙琳 （1993—），女，碩士研究生。E-mail：752773630@qq.com

通信作者：張敏瑩 （1974—），女，副研究員。E-mail：zhangmy@ffrc.cnEppendorf管中，向組織樣中加入裂解液 （440 μL STE，15 μL 10 mg/mL PK，50 μL 10%SDS），56℃下消化過(guò)夜；再加入與裂解液等體積的用Tris平衡的苯酚 （pH 8.0），輕搖30 min后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液移至新的1.5 mL離心管中；重復(fù)上述步驟，此次輕搖混勻時(shí)間為10 min；加入與上清液等體積的苯酚和氯仿/異戊醇（24∶1），輕搖10 min后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中；加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇 （24∶1），輕搖混勻30 min后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中；加入兩倍上清液體積的冰乙醇進(jìn)行沉淀。

Sequence variations and genetic differentiations in COⅠgene in two geographical populations of ice fish Protosalanx hyalocranius

ZHAO Lin1，2，ZHANG Min-ying1，XU Dong-po1，ZHOU Yan-feng1，F(xiàn)ANG Di-an1，DUAN Jin-rong1，LIU Kai1
（1.Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources and Environment in the Lower Reaches of the Changjiang River，Ministry of Agriculture，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi 214081，China；2.College of Fisheries，Nanjing Agricultural University，Wuxi 214081，China）

Abstract：Mitochondrial cytochrome oxidaseⅠ（COⅠ）gene was sequenced in 96 individuals of ice fish Protosalanx hyalocranius collected in Taihu Lake and Hongzehu Lake by purified PCR products in order to study genetic variations among different geographic populations of ice fish.The results showed that 6 variable sites accounting for 0.94%of total nucleotide were found in 638 bp sequences，with average content of 26.2%in A，34.0%in G，21.3%T and 18.5%in C.There was（A+T）content of 47.5%，lower than that of（G+C）（52.5%）.Seven haplotypes were found in analysis of haplotypes，with shared haplotypes of Hap1，hap5 and hap7，and specific Hap6 in Hongzehu Lake，and specific hap2，hap3 and hap4 in Taihu Lake.The average haplotype diversity（Hd）was found to be 0.642 and the nucleotide diversity（Pi）0.001 48，showing low genetic diversity.AMOVA analysis revealed that genetic variation was 79.82%within populations and the genetic variation between populations was 20.18%，with genetic differentiation index Fst of 0.201 79 between the two populations，indicating that there was higher genetic differentiation between the two populations.The findings could provide reference for rational development and utilization for wild ice fish stocks.

Key words：Protosalanx hyalocranius；geography population；cytochrome oxidaseⅠ（COⅠ）；genetic differentiation