張東升，王震，毛東東，冀婷婷，李華

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023）

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芽孢桿菌L15菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張東升，王震，毛東東，冀婷婷，李華

（大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023）

摘要：芽孢桿菌L15菌株能有效降低刺參Apostichopus japonicas養(yǎng)殖水中的化學(xué)耗氧量 （COD）和氨氮（NH+4-N）含量，促進刺參生長，為大量發(fā)酵培養(yǎng)L15菌株并降低培養(yǎng)成本，以豆粕、麥麩、玉米酒糟、棉籽粕為碳、氮源，對發(fā)酵培養(yǎng)L15菌株的最佳碳、氮源及其配比和最佳發(fā)酵條件 （如裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速等）進行了初步優(yōu)化研究。結(jié)果表明：培養(yǎng)芽胞桿菌L15菌株的最佳碳、氮源為麥麩和豆粕，最佳添加量分別為3、2 g/L；最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為裝液量1/3、接種量1%、轉(zhuǎn)速160 r/min；在最佳培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件下，發(fā)酵培養(yǎng)的L15菌株細菌數(shù)量可達1011cfu/mL，與用2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株相比，在實驗室條件下，對海參底泥COD的去除率雖無明顯變化，但培養(yǎng)成本卻降低了91%。研究表明，用豆泊和麥麩作為培養(yǎng)基培養(yǎng)L15菌株具有可行性，不僅細菌數(shù)量達標(biāo)，且培養(yǎng)成本顯著降低。

關(guān)鍵詞：刺參；芽孢桿菌L15菌株；發(fā)酵培養(yǎng)；正交試驗

刺參Apostichopus japonicas已成為中國北方最重要的海水養(yǎng)殖種類，2013年養(yǎng)殖面積達22萬hm2，年產(chǎn)量約19萬t［1］。然而，隨著刺參養(yǎng)殖時間的延長，每年春、夏季池塘?xí)a(chǎn)生大量的絲狀藻類，這些藻類死亡后造成池塘底部缺氧，有毒有害物質(zhì)如硫化氫 （H2S）、氨氮 （NH+4-N）等大量產(chǎn)生，致使刺參吐腸和死亡?；瘜W(xué)除草劑的使用能非常有效地抑制這些藻類的生長繁殖，但長期應(yīng)用這些化學(xué)藥物，不僅破壞了養(yǎng)殖池塘固有的微生態(tài)平衡［2-3］，而且藥物殘留影響刺參品質(zhì)。因此，綠色生態(tài)養(yǎng)殖是刺參養(yǎng)殖的最佳方式。

目前，微生態(tài)制劑的使用是快速去除底泥有機物、改善養(yǎng)殖環(huán)境、抑制大型藻類生長的綠色生態(tài)養(yǎng)殖方式之一。以刺參為研究對象的細菌微生態(tài)制劑包括光合細菌［4］、硝化細菌［5］、EM 菌［6-7］、枯草芽孢桿菌［8］和蛭弧菌［9］，具有提高刺參養(yǎng)殖池塘溶氧 （DO），降解NH+4-N、亞硝酸氮 （NO-2-N）、化學(xué)耗氧量 （COD）和破壞病害細菌的作用，但在去除底泥有機污染物方面效果不佳。2001年，李秋芬等［10］分離出能夠高效降解蝦池餌料的益生菌 （堅強芽孢桿菌Bacillus firmus Lt7222、枯草芽孢桿菌 B.subtilisGy7018 和環(huán)狀芽孢桿菌B.circulans Lt7511），這些菌對蝦池底泥有機質(zhì)去除率達43.52%。蝦池底泥與刺參養(yǎng)殖池底泥有機化學(xué)組成不同，分離高效降解刺參池塘底泥有機物的益生菌，是從根本上改善刺參池塘養(yǎng)殖環(huán)境、提高刺參品質(zhì)的有效舉措［11］。目前，除閆法軍等［12］報道了從刺參池塘中分離篩選有機污染物降解菌外，尚無其他報道。

作者曾經(jīng)從大連市某刺參養(yǎng)殖池塘中分離篩選出一株降解刺參養(yǎng)殖池塘有機質(zhì)的益生芽孢桿菌L15菌株，該菌可有效降低刺參養(yǎng)殖池中的COD 和NH+4-N含量，顯著促進刺參生長，經(jīng)鑒定與印度芽孢桿菌Bacillus indicus具有99%的相似性［13］，為大量發(fā)酵培養(yǎng)該菌株，并用于刺參池塘底泥的生物修復(fù)，本研究中對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了初步優(yōu)化研究，旨在為刺參的綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

芽孢桿菌L15菌株由大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院實驗教學(xué)中心自行分離保存。

麥麩、豆粕、玉米酒精糟、棉籽粕購自大連市

1.2方法

1.2.1菌種培養(yǎng) 取4℃下冷藏斜面保存的L15菌株，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，并置于25℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱里活化12 h，按1%接種量轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，待用。

1.2.2最佳碳、氮源的篩選和使用量的確定

（1）最佳碳、氮源篩選。配制含有0.01 g/L FePO4的陳海水，取10 mL置于50 mL大試管中，每5管為一組，每管按5 g/L分別加入麥麩、玉米酒精糟、豆粕、棉籽粕各0.05 g，或兩兩組合各加入0.025 g，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5，121℃下滅菌20 min，置于冰箱 （4℃）中保存待用。

（2）接種。每組取3只試管作為試驗組，每管接種培養(yǎng)12 h的細菌懸液0.1 mL，另2只試管作為對照組，不接種。將試驗組和對照組全部放入30℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中 （轉(zhuǎn)速150 r/min）培養(yǎng)24 h后取出，用721分光光度計測定吸光度 （波長為600 nm、寬為1 cm的玻璃比色皿），以試驗組吸光度與對照組吸光度的差，表示L15菌株的生長情況。

（3）最佳碳、氮源用量的確定。對篩選出的最佳碳、氮源，分別以1、2、3、4 g/L的濃度按L16（42）正交試驗設(shè)計添加到含有0.01 g/L FePO4的陳海水中進行試驗，培養(yǎng)基配制、細菌接種及培養(yǎng)和生長測量方法同上，根據(jù)正交試驗結(jié)果分析確定碳、氮源的最佳用量。

1.2.3L15菌株搖床發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗

以上述篩選的最佳碳、氮源和含有0.01 g/L FePO4的陳海水為培養(yǎng)基，篩選L15菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。培養(yǎng)條件設(shè)裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速3個因素，每個因素設(shè)3個水平 （表1），進行L9（34）正交試驗。根據(jù)正交試驗設(shè)計，將不同體積培養(yǎng)基裝于250 mL的三角燒瓶內(nèi)，滅菌方法同上；然后按正交試驗設(shè)計接種L15菌株到上述三角瓶內(nèi)，放入震蕩頻率不同的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度均為30℃，培養(yǎng)24 h后，測定其吸光度，根據(jù)結(jié)果進行方差分析，得到最佳培養(yǎng)條件。

1.2.4最佳培養(yǎng)條件的驗證

（1）細菌數(shù)量的測定。采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)L15菌株48 h，按常規(guī)平板涂布法在2216E培養(yǎng)基上進行計數(shù)。

表1　發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels of fermentation culture conditions in an orthogonal test

（2）對有機物質(zhì)COD去除效果的測定。使用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)L15菌株12 h。稱2 g刺參池塘風(fēng)干底泥放入裝有100 mL陳海水的250 mL三角燒瓶中，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5，121℃下滅菌30 min，按1%接菌量分別接種至兩種培養(yǎng)基中，各3瓶，于25℃下培養(yǎng)3 d，取適量，以4500 r/min離心10 min，采用高錳酸鉀法［14］測定上清液中的COD含量。

COD去除率=（接種前培養(yǎng)基上清液中COD含量-接種培養(yǎng)后上清液中COD含量）/接種前上清液COD含量×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1L15菌株最佳碳、氮源及其最佳用量

通過含有單一碳源或氮源培養(yǎng)基以及碳、氮源等比組合培養(yǎng)基培養(yǎng)L15菌株。結(jié)果表明，在豆粕與麥麩等比組合培養(yǎng)基培養(yǎng)下，L15菌株生長量最高，豆粕組次之，二者均顯著高于其他組 （P＜0.05），即豆粕與麥麩組合為發(fā)酵培養(yǎng)L15菌株生長的最佳碳、氮源 （表2）。

最佳碳、氮源的最佳用量確定：根據(jù)確定的最佳碳、氮源，設(shè)定碳、氮源取值范圍為1、2、3、4 g/L，以豆粕和麥麩為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，利用L16（42）正交試驗測定豆粕與麥麩不同濃度組合對L15菌株生長的影響。從表3可見，7號試驗組L15菌株生長效果最好，即豆粕2 g/L和麥麩3 g/L時，組菌生長量最多。從表3還可見：隨著豆粕用量的增加，L15菌株生長呈增加趨勢，但用量為2、3、4 g/L時，L15菌株生長無顯著性差異 （P＞0.05），極差僅為0.011，但均顯著高于用量為1 g/L時L15菌株的生長 （P＜0.05），說明豆粕用量為2 g/L時就已滿足了L15菌株生長要求；隨著麥麩用量的增加，L15菌株生長也呈增加趨勢，麥麩用量為3、4 g/L時，L15菌株生長顯著高于用量為1、2 g/L時 （P＜0.05），但用量為3、4 g/L時L15菌株生長量極差較小，僅為0.001，且無顯著性差異（P＞0.05），說明麥麩用量為3 g/L時，就已滿足了L15菌株的生長要求?？梢?，豆粕和麥麩用量分別為2、3 g/L組合時，L15菌株生長最好，這與正交試驗結(jié)果一致 （表3），此時L15菌株數(shù)量最多，可達109cfu/mL。

表2　不同碳、氮源對L15菌株生長的影響Tab.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on L15 strain growth

2.2L15菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件

以最佳碳、氮源配比為培養(yǎng)基，由L9（34）正交試驗結(jié)果和方差分析 （表4）可知，隨裝液量的增加，L15菌株生長呈下降趨勢，裝液量為1/3時，L15菌株生長最好，與裝液量為2/3時有顯著性差異 （P＜0.05）；隨接種量的增加，L15菌株生長呈下降趨勢，接種量為1%時，L15菌株生長最好，但與接種量為2%、4%時無顯著性差異 （P＞0.05）；轉(zhuǎn)速為160 r/min時，L15菌株生長最好，與轉(zhuǎn)速為140 r/min、180 r/min時有顯著性差異（P＜0.05），可見，L15菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為裝液量1/3、接種量1%、轉(zhuǎn)速160 r/min。使用最佳發(fā)酵條件培養(yǎng)L15菌株48 h，L15菌株生長量可達1011cfu/mL。

用2216E和本試驗中所得最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)L15菌株24 h，兩者對海參底泥有機質(zhì)COD的降解率無顯著性差異 （P＞0.05）（表5），用2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株對海參底泥有機質(zhì)96 h降解率為38.30%，用豆粕+麥麩培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株降解率為39.99%，說明本試驗中所得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株對COD降解效果略有提高。

表3　不同用量豆粕、麥麩培養(yǎng)L15菌株的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Design and results in the orthogonal test under different dosages of soybean meal and wheat bran

3　討論

印度芽孢桿菌最早被發(fā)現(xiàn)于印度孟加拉一受砷污染的淡水水域［15］，它對重金屬具有抗性。2009年首次發(fā)現(xiàn)印度芽孢桿菌存在于海水中［16-17］。Hong等［18］報道，可以將印度芽孢桿菌安全地用作食品添加劑；英國人從人體中分離出一株印度芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其菌株體內(nèi)含有特殊類胡蘿卜素，雖不能被胃酸分解，但人和動物攝食后，能夠提高其免疫力，已將其申請為生產(chǎn)特殊類胡蘿卜素的專利菌株。

表4　不同發(fā)酵條件培養(yǎng)L15菌株的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.4 Design and results in the orthogonal test of different fermentation conditions

表5　兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15菌株對刺參池塘底泥COD的去除率Tab.5 Removal rate of pond sediment COD by L15 strain cultivated in two culture media

盡管L15菌株與印度芽孢桿菌具有99%的相似性，且在糖的利用和發(fā)酵效果上也完全一致，但至今尚無印度芽孢桿菌大規(guī)模培養(yǎng)的文獻和專利資料，且同一種菌存在的地理和環(huán)境差異性，為進一步研究該菌株對海參養(yǎng)殖池塘底泥及水質(zhì)原位修復(fù)效果，需大量培養(yǎng)該菌株。目前，實驗室培養(yǎng)該細菌使用的是2216E培養(yǎng)基，其成本較高，為降低成本，需篩選物美價廉的原料作為培養(yǎng)基。而培養(yǎng)細菌最基本的營養(yǎng)成分為碳、氮源［19］，但每種細菌生長所需最佳碳、氮源的種類和比例不同，如蠟質(zhì)芽孢桿菌需要的最佳碳、氮源為玉米粉和黃豆粉，分別占培養(yǎng)基含量的0.5%［20］；枯草芽孢桿菌的最佳碳、氮源為麩皮、稻殼、玉米粉、豆粕，分別占培養(yǎng)基的80%、10%、5%、5%［21］，這與不同細菌分泌水解酶種類以及細胞化學(xué)組成不同有關(guān)。本研究中選擇了棉籽粕、豆粕、玉米酒精糟、麥麩作為碳、氮源，根據(jù)培養(yǎng)基配制及不影響L15菌株使用的原則，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)L15菌株的最佳碳、氮源為麥麩與豆粕，最佳含量分別為3、2 g/L。試驗證明，在含有最佳碳、氮源配比下的海水培養(yǎng)基中，L15菌株生長最好，培養(yǎng)的細菌數(shù)量與用2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)的相同，培養(yǎng)成本卻降低了91%。

為獲得更高的菌株產(chǎn)量，需要篩選最佳發(fā)酵條件，發(fā)酵條件一般包括發(fā)酵液初始pH、培養(yǎng)溫度、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速等。不同細菌因生理不同，所需發(fā)酵條件也不同，如蠟質(zhì)芽孢桿菌Bacillus cereus最佳發(fā)酵條件為裝液量1/5、接種量5%、發(fā)酵溫度28℃和轉(zhuǎn)速200 r/min［19］，而解磷巨大芽孢桿菌 B.megaterium的最佳發(fā)酵條件為溫度30℃、起始pH 8.0、裝液量20 mL/250 mL三角瓶、接種量3%、搖床轉(zhuǎn)速250 r/min［22］，裝液量和轉(zhuǎn)速都影響培養(yǎng)液的氧含量，接種量過大會帶進前期培養(yǎng)液廢物，接種量過小細菌生長速度減慢。本研究中根據(jù)前期試驗結(jié)果，確定了發(fā)酵培養(yǎng)L15菌株的最適發(fā)酵pH（7.0～7.5）和溫度 （30℃），僅對L15菌株發(fā)酵培養(yǎng)中的裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速3個條件進行了正交試驗。依據(jù)文獻資料［19，22］，選用裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速作為篩選發(fā)酵條件的指標(biāo)，得出L15菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為裝液量1/3、接種量1%、轉(zhuǎn)速160 r/min。在最佳碳 （麥麩3 g/L）、氮源 （豆粕2 g/L）和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下，L15菌株細菌數(shù)量可達1011cfu/mL，且發(fā)酵培養(yǎng)的L15細菌與用2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)的L15細菌相比對刺參底泥COD的去除效果略高。

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中圖分類號：S949

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.006

文章編號：2095-1388（2016）03-0261-05

收稿日期：2015-09-05

基金項目：國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目 （2014GB2B000366）；遼寧省漁業(yè)廳重點攻關(guān)項目 （201402）

作者簡介：張東升 （1963—），女，教授。E-mail：zhangdongsheng@dlou.edu.cn

通信作者：李華 （1958—），女，博士，教授。E-mail：lihua@dlou.edu.cn開發(fā)區(qū)某飼料廠，培養(yǎng)基的其他成分為化學(xué)分析純試劑。

Optimization of fermentation and culture conditions of Bacillus L15 strain

ZHANG Dong-sheng，WANG Zhen，MAO Dong-dong，JI Ting-ting，LI Hua
（Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：Bacillus strain L15 was isolated from sea cucumber Apostichopus japonicas culture ponds in Dalian and found to be effectively reduced levels of COD and NH+4-N in the sea cucumber ponds and significantly promoted the growth of sea cucmber.The strain L15 was cultured in media of soybean meal，wheat bran，corn distillers，cottonseed meal to optimize carbon and nitrogen sources and fermentation conditions including loading volume，inoculation quantity，and rotational speed in order to reduce cost in mass fermentation cultivation of L15 strain.The results showed that the best fermentation culture of L15 strain was observed under conditions of soybean meal and wheat bran as carbon（3 g/L）and nitrogen（2 g/L）sources，1/3 loading volume，1%inoculation quantity，and rotational speed of 160 r/min，with density of 1011cfu/mL，and without significant difference in degradation rate of COD in the sea cucumber pond sediments by the cultivated L15 strain compared with 2216E medium cultivation of L15 strain under the condition of indoor experiments.However，the cultivation cost was found to be decreased by 91%，indicating that it is feasible to cultivate L15 strain for use of beans and wheat bran to meet bacterial number requirement.

Key words：Apostichopus japonicus；Bacillus L15 strain；fermentation cultivation；orthogonal experiment