姚洪，張吉鵬，楊川，張利娟，樸元植，劉月芬，葉仕根，李華

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.盤錦市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，遼寧盤錦124010）

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遼寧一例凡納濱對蝦大規(guī)模死亡的病原研究

姚洪1，張吉鵬1，楊川1，張利娟1，樸元植2，劉月芬2，葉仕根1，李華1

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.盤錦市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，遼寧盤錦124010）

摘要：為對遼寧省盤錦地區(qū)2014年出現(xiàn)的大規(guī)模死亡凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei展開病原研究，對死蝦進行了白斑綜合征病毒 （WSSV）、桃拉病毒 （TSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病病毒 （IHHNV）和嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila的分析鑒定，提取病蝦鰓組織DNA/RNA后，以特異性引物進行WSSV、TSV和IHHNV病毒檢測，通過16S rDNA測序及嗜水氣單胞菌特異性引物和氣溶素基因的雙重PCR對分離菌株QD1進行分類鑒定，并對病蝦的鰓、胃、肝胰腺和附肢進行了組織病理切片觀察。結(jié)果表明：患病對蝦WSSV和TSV檢測呈陽性；菌株QD1為嗜水氣單胞菌，其人工回歸感染試驗結(jié)果顯示，分離菌株能使健康凡納濱對蝦致病死亡；組織病理學(xué)觀察顯示，病蝦鰓及胃組織出現(xiàn)大量WSSV特征性的病變核，肝胰腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，肝胰腺管腔變大，部分肝細(xì)胞壞死，肝胰腺管之間結(jié)締組織中血細(xì)胞明顯增多。研究表明，此次凡納濱對蝦大量死亡為WSSV和TSV兩種病毒與嗜水氣單胞菌混合感染所致。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；白斑綜合征病毒；桃拉病毒；嗜水氣單胞菌；組織病理

凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei于1988年被引進中國以來，在養(yǎng)殖過程中已取代了中國對蝦并獲得了巨大的經(jīng)濟效益。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，凡納濱對蝦的病害狀況日趨突出，以桃拉病毒（TSV）病、白斑綜合征病毒 （WSSV）?。?］，以及引起早期死亡綜合征的弧菌［2-3］和引起紅腿、腸炎的嗜水氣單胞菌等細(xì)菌病最為嚴(yán)重［4］。近年來，中國南、北方養(yǎng)殖蝦苗排塘率很高，損失較大；而全球每年有大約40%的熱帶養(yǎng)殖蝦會因不當(dāng)?shù)牟《静〉念A(yù)防措施損失近30億美元［5］。早期養(yǎng)殖凡納濱對蝦大量死亡的原因說法不一，被稱為偷死病、肝胰腺壞死病、早期死亡綜合征等，其病原認(rèn)為是副溶血弧菌的特異變種。也有人認(rèn)為，其病原是黃頭桿狀病毒（YHV）新型病毒，弧菌是繼發(fā)性感染，或直接原因是弧菌感染，而根本原因是蝦苗抗逆性下降。還有觀點認(rèn)為，對蝦大量死亡是藻毒素所引起的中毒現(xiàn)象［6］。目前，多數(shù)學(xué)者傾向于病原是副溶血弧菌。探明對蝦大量死亡的原因有利于掌握對蝦疾病防控主動權(quán)，對成功養(yǎng)殖對蝦具有重要意義。

2014年以來，遼寧對蝦養(yǎng)殖規(guī)模又一次迅速擴大，同時蝦病也隨之出現(xiàn)。2014年7月下旬，遼寧省盤錦地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對蝦出現(xiàn)大規(guī)模死亡，發(fā)病面積達40%，有些蝦塘死亡率達到80%～90%。本研究中對患病對蝦的病原進行了分離、鑒定和分析，旨在為中國北方地區(qū)凡納濱對蝦的病害防控提供借鑒。

1　材料與方法

1.1材料

試驗用患病凡納濱對蝦采自遼寧省盤錦地區(qū)7個海水養(yǎng)殖蝦場，體長為4.0～5.0 cm；病蝦活體充氧運到大連海洋大學(xué)病害實驗室后，在無菌條件下按各種樣品檢測要求分別進行處理。

試驗用健康凡納濱對蝦采自普蘭店未發(fā)病養(yǎng)殖蝦場，體長為5.0～6.0 cm，對蝦活體充氧運回實驗室后，經(jīng)PCR檢測TSV和WSSV為陰性，暫養(yǎng)一周無異常癥狀后，分池進行試驗。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌學(xué)檢查 無菌條件下，使用胰蛋白胨

1.2.2菌株鑒定

（1）細(xì)菌16S rDNA序列的測定。采用水煮法提取DNA［7］。引物采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，上游引物為27F：5＇AGAGTTTGATCCTGG 3＇，下游引物為1492R：5＇GGTTACCTTGTTACGACTT 3＇。PCR產(chǎn)物送往北京華大基因研究中心進行測序，測序結(jié)果通過BLAST軟件進行比對。

（2）嗜水氣單胞菌16S rDNA和氣溶素基因的雙重PCR檢測。細(xì)菌模板DNA的制備同上。

PCR擴增嗜水氣單胞菌的16S rDNA和氣溶素基因 （aerA），參照王友娟等［8］的方法。16S rDNA基因的上游引物為5＇GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA 3＇，下游引物為5＇CGTGCTGGCAACAAAGGACAG 3＇，擴增產(chǎn)物長度為685 bp。氣溶素基因的上游引物為5＇GCAGAACCCATCTATCCAG 3＇，下游引物為5＇TTTCTCCGGTAACAGGAT TG 3＇，擴增產(chǎn)物片段為252 bp。上述引物均委托上海生物工程有限公司合成。

采用 25 μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPMix 2μL，引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，模板 （40～80 ng）1 μL，Taq DNA Polymerase（BBI）0.125 μL，用ddH2O補充至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，50℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進行30個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。取出后置于冰箱 （4℃）中保存。

取3 μL產(chǎn)物與1 μL 6×loading buffer混合后，點樣于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳孔中，在0.5×TBE緩沖液中，在120 V電壓下電泳15 min，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照和判定。

判定方法：在陰、陽性對照成立的情況下，無任何條帶出現(xiàn)，說明菌株非嗜水氣單胞菌；僅在16S rDNA片段處出現(xiàn)條帶，說明菌株為嗜水氣單胞菌；在兩個目的片段處均出現(xiàn)條帶，說明菌株為致病性嗜水氣單胞菌。

1.2.3病毒檢測 取病蝦鰓組織打碎研磨成細(xì)胞懸液，使用DNA提取試劑盒 （TIANamp Genomic DNA Kit）提取DNA。通過試劑盒 （購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司）檢測對蝦白斑綜合征病毒 （WSSV）、桃拉病毒 （TSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒 （IHHNV）。

判定方法：在陰、陽性對照成立的情況下，若在目的片段處出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，說明病蝦組織樣品中存在該病毒；反之，則不含有該病毒。

1.2.4組織病理 取患病凡納濱對蝦的胃、鰓、肝胰腺、腸、附肢等組織，用波恩試劑固定24 h后，用酒精梯度脫水、石蠟包埋，經(jīng)H.E染色后在顯微鏡下觀察。

1.2.5分離菌致病性的確定 人工感染試驗在80 cm×50 cm×50 cm的水槽中進行，水體為120 L，水溫為21～22℃，鹽度為30。每個試驗組隨機分配10只對蝦，將培養(yǎng)24 h的細(xì)菌用無菌生理鹽水洗脫，制成活菌終濃度為1.0×107cells/mL的菌懸液，注射到每只對蝦腹部第一、二節(jié)肌肉中，每尾注射0.1 mL，對照組注射等量生理鹽水，持續(xù)觀察14 d。試驗過程中及時撈出瀕死對蝦，進行細(xì)菌再分離，并進行鑒定 （方法同上）。

1.2.6藥物敏感試驗 采用紙片擴散法［9］進行試驗。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

2　結(jié)果與分析

2.1患病蝦的臨床癥狀及剖檢

自2014年7月初開始，遼寧省盤錦地區(qū)部分養(yǎng)殖蝦塘的對蝦身體發(fā)紅，尤其附肢、游泳足、尾扇變紅，吃食減少，病重時不攝食，死亡迅速，且死亡率高 （圖1-A），發(fā)病面積達養(yǎng)蝦面積的40%。剖檢發(fā)現(xiàn)，其頭胸甲甲殼內(nèi)側(cè)有白斑 （圖1-B），頭胸甲易剝離，且甲殼與真皮不黏連，肝胰臟顏色較淺，空腸空胃或腸內(nèi)食物不連續(xù)。

2.2細(xì)菌的分離與鑒定

2.2.116S rDNA鑒定 從病蝦樣品中分離出1株優(yōu)勢菌株，優(yōu)勢度為50%，命名為QD1。采用通用引物擴增菌株QD1的16S rDNA，獲得大小為1465 bp的目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)與GenBank中數(shù)據(jù)作BLAST比對，菌株QD1與氣單胞菌屬Aeromonas的一致性達100%。

2.2.2雙重PCR檢測 將菌株QD1進一步進行嗜水氣單胞菌特異性基因和氣溶素基因的雙重PCR檢測，發(fā)現(xiàn)該菌在252 bp和685 bp處均出現(xiàn)清晰條帶。說明分離菌株為致病性嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila。

圖1　患病對蝦的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of the diseased shrimp

圖2　雙重PCR擴增分離菌株的特異性基因和氣溶素基因的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.2 Agarose elelectrophoresis of specific genes and aerolysin gene from an isolate by dual PCR and 16S rDNA

圖3　WSSV和TSV檢測結(jié)果Fig.3 Testing results of WSSV and TSV

圖4　患病對蝦細(xì)胞病變組織的顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 Microstructure of cell lesions in diseased shrimp

2.3病毒檢測

WSSV和TSV特異性擴增產(chǎn)物分別為300 bp 和210 bp的全長基因片段，樣品組和陽性對照組在其目的條帶處均出現(xiàn)亮帶 （圖3）。但TSV樣品組條帶彌散，為進一步確定是否為TSV，經(jīng)對RTPCR產(chǎn)物進行膠回收，連接T載體轉(zhuǎn)化到DH5α后進行測序，測序結(jié)果通過BLAST軟件與已知TSV進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與AY826058.1一致性達到99%，可判定為陽性；IHHNV 3對特異性引物的擴增產(chǎn)物在目的條帶處均沒有出現(xiàn)亮帶。

2.4組織病理觀察

患病凡納濱對蝦的胃上皮細(xì)胞和結(jié)締組織、鰓組織中存在大量膨大及濃染的特異性病變核（圖4-A、B），但組織結(jié)構(gòu)比較完整；病輕的個體肝胰腺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，肝胰腺上皮細(xì)胞及肝胰腺管之間的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)基本完好，只有個別的肝小管破碎，而病情較重的病蝦多數(shù)肝胰腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，管腔變大，分泌細(xì)胞嚴(yán)重減少或不見，部分肝細(xì)胞壞死，甚至自溶，肝胰腺管之間結(jié)締組織中血細(xì)胞明顯增多 （圖4-C、D）；中腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完好，附肢組織切片未見明顯病理變化。

2.5人工感染試驗

人工感染試驗結(jié)果表明，試驗組第一天就開始出現(xiàn)死亡，2天內(nèi)致死率為100%，說明菌株毒力較強，而對照組未出現(xiàn)任何癥狀。

2.6藥敏試驗

從患病凡納濱對蝦分離出的優(yōu)勢菌株對16種抗菌藥物的敏感性結(jié)果統(tǒng)計見表1。結(jié)果表明，該菌對氟哌酸等喹諾酮類、慶大霉素等4種藥物較為敏感，對氟苯尼考、吡哌酸等4種藥物中度敏感，對先鋒V、四環(huán)素、利福平等8種藥物不敏感。

表1　分離菌對藥物的敏感性Tab.1 Sensitivity of the pathogenic bacteria to drugs

3　討論

本研究中的凡納濱對蝦病蝦頭胸甲甲殼內(nèi)白斑明顯，頭胸甲甲殼極易剝離且不與下面的真皮黏連、空胃且消化道內(nèi)無食物，在病蝦鰓組織樣品中檢測出WSSV和TSV病毒，說明病蝦已感染對蝦白斑征病毒和桃拉病毒。但無論是PCR結(jié)果還是病理切片結(jié)果均顯示，WSSV病毒感染更嚴(yán)重。病蝦的臨床癥狀未顯示出體表具無規(guī)則的斑點、壞死灶或甲殼變黑等桃拉病的特殊病理特征［10］；病蝦身體發(fā)紅，尤其附肢、游泳足、尾扇變紅，但這一癥狀并非對蝦桃拉病所特有，凡納濱對蝦在感染W(wǎng)SSV病毒和細(xì)菌時均呈現(xiàn)紅體癥狀［11］；病理組織切片則顯示，盡管鰓、胃已有大量的組織和細(xì)胞感染W(wǎng)SSV病毒，其特征性的病變核在上皮和結(jié)締組織中隨處可見，但在鰓、胃、附肢和后腸未見上表皮壞死，也未見 “胡椒粉狀”或 “散彈狀”病灶［12］。PCR檢測結(jié)果與臨床癥狀和組織病理觀察結(jié)果吻合，因此，可認(rèn)為病蝦感染W(wǎng)SSV病毒更嚴(yán)重；在病蝦體內(nèi)分離到優(yōu)勢度很高的嗜水氣單胞菌，毒力基因檢測顯示，該菌具有氣溶素基因，是致病菌，人工感染試驗驗證其致病性很強。綜上，推測此次對蝦大量發(fā)病死亡的原因是WSSV和TSV兩種病毒與嗜水氣單胞菌混合感染所致。

近年養(yǎng)殖的凡納濱對蝦中，WSSV病毒的感染較普遍，但如果養(yǎng)殖環(huán)境控制較好，養(yǎng)殖管理規(guī)范，即使感染病毒的對蝦也可以不發(fā)病或發(fā)病較輕，其死亡率往往與養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖管理水平呈反比［13］。王利強［14］也認(rèn)為，凡納濱對蝦對WSSV病毒有一定抵抗力，僅感染W(wǎng)SSV病毒的凡納濱對蝦，在對蝦幼體、環(huán)境等條件正常的情況下不會造成高死亡率。中國北方7月雨水較少，養(yǎng)殖水體鹽度偏高，水溫急劇升高，養(yǎng)殖環(huán)境變化較大，被病毒感染的凡納濱對蝦抵抗力下降，嗜水氣單胞菌的感染加速了對蝦的大量死亡。嗜水氣單胞菌的致病范圍很廣，蝦類也是其主要的感染對象之一［15］。20世紀(jì)90年代就有學(xué)者報道，嗜水氣單胞菌可導(dǎo)致中國對蝦和紅螯螯蝦患敗血癥［16-17］。學(xué)界一般認(rèn)為，嗜水氣單胞菌主要感染淡水魚類，但作者從海水養(yǎng)殖的凡納濱病蝦樣本中分離出優(yōu)勢度很高的嗜水氣單胞菌，且致病性很強，應(yīng)在養(yǎng)殖凡納濱對蝦過程中重點防控。

病理切片結(jié)果顯示，病蝦肝胰腺病變較嚴(yán)重。病情較重的病蝦肝胰腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，上皮細(xì)胞變矮，管腔變大，分泌細(xì)胞嚴(yán)重減少或不見，部分肝細(xì)胞壞死，說明病蝦肝功能嚴(yán)重降低，肝胰腺管之間結(jié)締組織中血細(xì)胞明顯增多，應(yīng)該是機體對細(xì)菌入侵的防御性反應(yīng)結(jié)果。上述病理變化與早期死亡綜合征病蝦的肝胰腺病理變化相似［18］。作者認(rèn)為，WSSV和TSV病毒均不會引起肝胰腺大量病變和壞死，本次病蝦肝胰腺病變主要由嗜水氣單胞菌感染所致，是氣單胞菌分泌的外毒素［19］引起組織嚴(yán)重變性和壞死的結(jié)果。顯然，致病性較強的細(xì)菌感染，均能引起肝胰腺病變，進而導(dǎo)致蝦體抵抗力急速降低，代謝水平嚴(yán)重下降，直至新陳代謝停止，引起死亡。因此，在凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中，對不同區(qū)域和不同養(yǎng)殖階段的各種病例應(yīng)進行及時、綜合、準(zhǔn)確診斷，尤其對養(yǎng)殖苗種及養(yǎng)殖過程中對蝦攜帶的病原應(yīng)及時跟蹤監(jiān)測，為養(yǎng)殖生產(chǎn)制定出有效的防控措施。

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中圖分類號：Q954.4

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.005

文章編號：2095-1388（2016）03-0256-05

收稿日期：2015-09-16

基金項目：遼寧省海洋漁業(yè)廳重點攻關(guān)項目 （201402）

作者簡介：姚洪 （1991—），男，碩士研究生。E-mail：1575559024@qq.com

通信作者：李華 （1958—），女，博士，教授。E-mail：lihua@dlou.edu.cn大豆瓊脂 （TSA），以平板劃線法從患病對蝦心臟、肝胰腺等部位分離細(xì)菌，在28℃下培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長情況。取優(yōu)勢菌純化3次，置于裝有20%甘油的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于超低溫冰箱（-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

A pathogen in mass death of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in Liaoning Province

YAO Hong1，ZHANG Ji-peng1，YANG Chuan1，ZHANG Li-juan1，PIAO Yuan-zhi2，LIU Yue-fen2，YE Shi-gen1，LI Hua1
（1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Panjin Fisheries Technique Extending Station，Panjin 124010，China）

Abstract：In this paper，white spot syndrome virus（WSSV），Taurus virus（TSV），Infectious hypodermal，hematopoietic necrosis virus（IHHNV）and pathogenic bacterium Aeromonas hydrophila were identified in diseased and mass death of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei collected from Panjin region in Liaoning Province with specific primer after extracting DNA/RNA from gill tissue，16S rDNA sequencing and double PCR identification in specific primer and aerolysin gene of the pathogenic bacterium was identified to classify strain QD1.The tissue pathological observation was carried out on gills，stomach，hepatopancreas and appendages of the diseased shrimps. The results showed that WSSV and TSV were positive to the disease，and that the isolated strain was proved to be classified as Aeromonas hydrophila which led to the shrimp death by artificial challenged.Histopathological observation revealed that there was a large number of nuclei of WSSV in gill and stomach of the diseased shrimp.The severe atrophical epithelial cells，larger lumen，part of the hepatic cell necrosis and blood cells were observed in the hepatopancreas of the diseased shrimp.Comprehensive analysis confirmed that it is the mixed infection of 2 species of virus and Aeromonas hydrophila in a large number of Pacific white leg shrimp death.

Key words：Litopenaeus vannamei；WSSV；TSV；Aeromonas hydrophila；histopathology