王欣，許宏賢，周鵬，段鋼

(杰能科(中國(guó))生物工程有限公司，江蘇 無(wú)錫，214028)

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肉桂醛和百里香酚對(duì)生料工藝酒精發(fā)酵的影響

王欣，許宏賢，周鵬，段鋼*

(杰能科(中國(guó))生物工程有限公司，江蘇 無(wú)錫，214028)

摘要肉桂醛和百里香酚具有較強(qiáng)的抑菌活性，常用于食品的保鮮和防腐，也可作為飼料添加劑。文中對(duì)肉桂醛和百里香酚對(duì)生料工藝酒精發(fā)酵的影響進(jìn)行了研究。表明肉桂醛和百里香酚在酒精發(fā)酵中有一定的抑菌效果；以大米為原料時(shí)，10 μg/L的肉桂醛和50 μg/L的百里香酚使酒精產(chǎn)量分別提高了1.7%和0.7%；以玉米為原料時(shí)，50 μg/L的肉桂醛提高酒精產(chǎn)量2.0%，25 μg/L百里香酚提高1.43%；但如果繼續(xù)提高肉桂醛和百里香酚的濃度，會(huì)抑制酵母的生長(zhǎng)，導(dǎo)致酒精產(chǎn)量降低。

關(guān)鍵詞肉桂醛；百里香酚；生料發(fā)酵；酒精

無(wú)蒸煮過(guò)程又稱(chēng)生料制酒也稱(chēng)一步發(fā)酵，是指在低于淀粉糊化的溫度下用生料淀粉水解酶與酵母共同作用于淀粉質(zhì)原料產(chǎn)生酒精的過(guò)程。無(wú)蒸煮過(guò)程工藝已經(jīng)在歐美國(guó)家得到了商業(yè)上的廣泛應(yīng)用[1]，最有希望解決酒精生產(chǎn)中能耗高，效率低的問(wèn)題。在酒精生產(chǎn)上，生料酶技術(shù)的使用，省去了高溫蒸煮過(guò)程，由于減少了淀粉在高溫時(shí)的損失，以及在生料酶的作用下系統(tǒng)中糖濃度很低，使得酵母產(chǎn)酒精的效率很高，因此淀粉轉(zhuǎn)化率大大提高[2]。但是，值得注意的是，生料酒精發(fā)酵是在無(wú)蒸煮的情況下進(jìn)行，存在染菌的危險(xiǎn)，這是必須考慮的因素之一。有研究表明，從酒精發(fā)酵中分離出的細(xì)菌有乳桿菌屬(Lactobacillus)、小球菌屬(Pediococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、醋桿菌屬(Acetobacter)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和梭菌屬(Clostridium)等[3]，幾乎有2/3的所分離的細(xì)菌屬于乳酸細(xì)菌,例如乳桿菌[4]。最近幾年，DDGS中抗生素的殘留問(wèn)題越來(lái)越得到重視，所以應(yīng)在酒精生產(chǎn)中盡量避免使用抗生素。

安惠華TMEO是杜邦工業(yè)生物科技部丹尼斯克動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)最新推出的一種經(jīng)過(guò)細(xì)致平衡、內(nèi)含高濃度百里香酚和肉桂醛的混合物，可作為飼料添加劑用于仔豬多發(fā)病飼養(yǎng)，而由于肉桂醛和百里香酚具有良好的抑制真菌的效果，也廣泛應(yīng)用于食品加工和保存中的防腐保鮮，是中國(guó)、歐盟和美國(guó)都允許使用的食品添加劑。如果將安惠華TMEO應(yīng)用到生料酒精生產(chǎn)中，能否達(dá)到抑制雜菌的生長(zhǎng)，從而減少原料損失提高酒精產(chǎn)出，又能使安惠華TMEO在DDGS 中繼續(xù)發(fā)揮作用從而提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，本文對(duì)此進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)原料

全磨大米粉(泰國(guó))；全磨玉米粉(中糧豐原燃料酒精有限公司提供)；安琪牌釀酒高活性干酵母(耐高溫型)。

1.1.2主要酶制劑

高溫淀粉酶：SPEZYME ALPHA，杰能科國(guó)際公司，酶活力129 766 wu/g；糖化酶：GA-L-NEW，杰能科國(guó)際公司，酶活力100 000 wu/g；生料酶STARGEN 002，杰能科國(guó)際公司，酶活力570 GAU/g。

1.1.3主要試劑

TSA培養(yǎng)基：德國(guó)默克公司；尿素：國(guó)藥集團(tuán)；無(wú)水乙醇、葡萄糖、麥芽糖、甘油、乳酸、乙酸均購(gòu)自北京色譜中心，為色譜級(jí)。肉桂醛、百里香酚：國(guó)藥集團(tuán)；Lactobacillusplantarum和Lactobacillusrhamnosus購(gòu)自CICC菌種中心

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓液相色譜，Agilent 1200系列；恒溫循環(huán)器，賽默飛世爾科技(卡爾斯魯厄)公司；顯微鏡，BX53F,配DT2000 真彩色圖像分析系統(tǒng)；Quanta-2000電子顯微鏡，荷蘭FEI公司制造。

1.3分析方法

1.3.1發(fā)酵醪組成測(cè)定

高效液相色譜法，Agilent HP1200 高效液相色譜儀,HP Chemstations色譜工作站,色譜柱Bio-rad 87H。色譜分離操作條件(常溫下進(jìn)行)流動(dòng)相:0.005 mol/L H2SO4;流速 0.6 mL/min; 柱溫60 ℃; 進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2酵母數(shù)量的統(tǒng)計(jì)

血球計(jì)數(shù)法，取一定發(fā)酵液稀釋?zhuān)?滴在血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以每個(gè)血球計(jì)數(shù)板中格中有30～80個(gè)酵母為宜。

2結(jié)果與討論

2.1安惠華TMEO101G 對(duì)乳桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)

有研究表明，在酒精發(fā)酵過(guò)程染有的雜菌中幾乎2/3的為乳酸細(xì)菌，例如乳桿菌，故本文針對(duì)安惠華TMEO101G對(duì)乳桿菌的抑菌情況做了研究，取本實(shí)驗(yàn)室的Lactobacillusplantarum和Lactobacillusrhamnosus培養(yǎng)于添加了不同濃度的安惠華TMEO101G液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后觀察，發(fā)現(xiàn)雖然安惠華TMEO101G的質(zhì)量濃度在0.1～1 g/L時(shí)仍然有乳酸菌生長(zhǎng)，但是其長(zhǎng)勢(shì)逐漸減弱，并且在質(zhì)量濃度達(dá)到1.5 g/L時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有乳桿菌生長(zhǎng)。

表1　EO101G 對(duì)乳桿菌的抑制情況

2.2安惠華TMEO101G 對(duì)以大米為原料的生料發(fā)酵的影響

取一定量的全磨大米粉，以每個(gè)發(fā)酵三角瓶含100 g醪液計(jì)，加入33 g全磨大米和67 g自來(lái)水，加入安惠華TMEO101G，分別控制質(zhì)量濃度在0.1，0.5,1和5 g/L，用26%的濃H2SO4調(diào)節(jié)pH為4.5左右，然后加入2.0 kg/MT 的生料酶STARGEN 002，600 μg/L的尿素和0.1%的干酵母粉，在32 ℃的水浴鍋中培養(yǎng)，培養(yǎng)70 h后取樣采用HPLC測(cè)定發(fā)酵醪的組成和酒精含量。

由圖1可以看出，在發(fā)酵前期安惠華TMEO101G的添加導(dǎo)致了22 h時(shí)酒精含量的降低，說(shuō)明安惠華TMEO101G的添加造成了酒精發(fā)酵的延遲，但是隨著酒精發(fā)酵的進(jìn)行，0.1～1 g/L的EO101G對(duì)酒精發(fā)酵的抑制作用減弱，反而在發(fā)酵結(jié)束時(shí)增加了最終的酒精含量，EO101G質(zhì)量濃度在1.0 g/L時(shí)酒精產(chǎn)量達(dá)到了15.98%vol，比對(duì)照(15.60%vol)提高了2.43%。但是EO101G的質(zhì)量濃度增加到5 g/L時(shí)，完全抑制了生料酒精發(fā)酵，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)也沒(méi)有酒精的產(chǎn)生。

圖1　EO101G 對(duì)大米原料生料酒精發(fā)酵的影響Fig.1　The effect of EO101G on rice no-cooking process ethanol fermentation

2.3肉桂醛和百里香酚對(duì)大米生料發(fā)酵的影響

由于安惠華TMEO101G的有效成分主要為肉桂醛和百里香酚，故本文對(duì)肉桂醛和百里香酚分別對(duì)大米生料發(fā)酵的影響進(jìn)行了研究，并且針對(duì)肉桂醛和百里香酚對(duì)發(fā)酵醪中酵母數(shù)量的影響進(jìn)行了研究。

由圖2可以看出肉桂醛和百里香酚的添加減少了發(fā)酵醪中的酵母數(shù)量，并且隨著濃度的增加，發(fā)酵醪中的酵母數(shù)量逐漸降低，但這并沒(méi)有影響其發(fā)酵效率，數(shù)據(jù)表明質(zhì)量肉桂醛質(zhì)量濃度在10 μg/L時(shí)酒精產(chǎn)量達(dá)到了15.80%vol，比對(duì)照(15.53%vol)提高了1.7%，百里香酚質(zhì)量濃度在50 μg/L時(shí)酒精產(chǎn)量達(dá)到了15.65%vol，比對(duì)照(15.53%vol)提高了0.7%。但是隨著肉桂醛和百里香酚濃度的繼續(xù)增加，最終酒精產(chǎn)量卻降低了，所以肉桂醛和百里香酚在低濃度可以促進(jìn)酒精發(fā)酵提高酒精產(chǎn)量，但在高濃度時(shí)反而能抑制酒精發(fā)酵。

圖2　肉桂醛和百里香酚對(duì)大米原料的生料發(fā)酵的影響Fig.2　The effect of Cinnamaldehyde and Thymol on rice no-cooking process ethanol fermentation

2.4肉桂醛和百里香酚對(duì)玉米生料發(fā)酵的影響

取一定量的全磨玉米粉，以每個(gè)發(fā)酵三角瓶含100 g醪液計(jì)，加入33 g全磨玉米和67 g自來(lái)水，分別加入肉桂醛5，25和50 μg/L，百里香酚10，25，50和100 μg/L，用26%的濃H2SO4調(diào)節(jié)pH為4.5左右，然后加入2.0 kg/MT 的生料酶STARGEN 002，600 μg/L的尿素和0.1%的干酵母粉，在32 ℃的水浴鍋中培養(yǎng)，培養(yǎng)70 h后取樣用HPLC測(cè)定發(fā)酵醪的組成和酒精含量。由圖3可以看出，肉桂醛含量在5～50 μg/L時(shí)提高了最終酒精產(chǎn)量，在50 μg/L時(shí)酒精產(chǎn)量達(dá)到了14.30%vol，比對(duì)照(14.02%vol)提高了2.0%，百里香酚含量在10～25 μg/L時(shí)提高了最終酒精產(chǎn)量，在25 μg/L時(shí)酒精產(chǎn)量達(dá)到了14.22%vol，比對(duì)照提高了1.43%， 但是隨著肉桂醛和百里香酚質(zhì)量濃度的繼續(xù)提高，最終酒精產(chǎn)量逐漸降低。

圖3　肉桂醛和百里香酚對(duì)玉米原料的生料發(fā)酵的影響Fig.3　The effect of Cinnamaldehyde and Thymol on corn no-cooking process ethanol fermentation

綜上所述, 在酒精生料發(fā)酵過(guò)程中分別添加肉桂醛或百里香酚或者添加二者的混合物，可以達(dá)到抑制雜菌的生長(zhǎng)從而減少原料損失提高酒精產(chǎn)出的目的。考慮到肉桂醛和百里香酚在飼料中的作用，在酒精生料發(fā)酵過(guò)程添加這些物質(zhì)提高了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.5肉桂醛和百里香酚對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

由于高濃度的肉桂醛和百里香酚在酒精生料發(fā)酵過(guò)程中能夠抑制酵母生長(zhǎng)從而導(dǎo)致酒精產(chǎn)量降低，本文針對(duì)肉桂醛和百里香酚對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響進(jìn)行了研究。取一定量的干酵母溶解于100 mL自來(lái)水中，分別加入100 μg/L的肉桂醛和230 μg/L的百里香酚作用4 h之后，在江南大學(xué)進(jìn)行掃描式電子顯微鏡觀測(cè)。由圖4可以看出，經(jīng)過(guò)高濃度的肉桂醛和百里香酚處理的酵母細(xì)胞壁出現(xiàn)了褶皺型的畸形，BENNIS[5]在研究百里香酚和丁子香酚對(duì)酵母細(xì)胞壁的影響中也曾經(jīng)報(bào)道過(guò)這種現(xiàn)象，并且汪琨[6]等人在研究中發(fā)現(xiàn)，肉桂醛特異性抑制真菌細(xì)胞壁葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成是其抑制真菌細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一。

(a)對(duì)照；(b)100 μg/L肉桂醛作用4h；(c)230 μg/L百里香酚作用4h圖4　肉桂醛和百里香酚對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.4　Scanning electronic microscope of S. cerevisiae

3討論

關(guān)于肉桂精油和百里香酚的抑菌作用機(jī)制的說(shuō)法很多,趙丹[9]等人在研究中指出當(dāng)肉桂精油作用于微生物菌體時(shí),破壞了菌體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),體內(nèi)的一些重要離子(如K+和Na+)也隨之流出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部的多種生物酶不能正常合成,從而阻礙了細(xì)胞的代謝活動(dòng)。此外,胞內(nèi)離子對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓起到十分重要的作用,胞內(nèi)離子流失則會(huì)影響內(nèi)外滲透壓的調(diào)節(jié),破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。而戴向榮[10]等人在研究中則表明肉桂醛能通過(guò)損傷黃曲霉細(xì)胞質(zhì)膜而進(jìn)入細(xì)胞，使胞內(nèi)大分子空間結(jié)構(gòu)改變并且有序的新陳代謝被破壞，導(dǎo)致抑制黃曲霉的生長(zhǎng)。這些都驗(yàn)證了肉桂精油通過(guò)先破壞菌體的表面結(jié)構(gòu),使其失去對(duì)周?chē)镔|(zhì)的選擇性,不能通透性地吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),當(dāng)濃度達(dá)到一定程度時(shí)殺死了菌體,菌株生長(zhǎng)則被完全抑制。

關(guān)于抑菌劑對(duì)酒精發(fā)酵的研究有很多，研究最多的就是乙酸和乳酸等抑菌劑對(duì)酒精發(fā)酵的影響[7]，如TARA GRAVES[8]在研究中就指出乙酸和乳酸在低濃度時(shí)能夠提高酒精產(chǎn)量，減少酵母數(shù)量，但是隨著濃度增加酒精產(chǎn)量也逐漸降低，這跟肉桂醛和百里香酚對(duì)生料酒精發(fā)酵的影響十分相似，酵母數(shù)量雖然減少，但是其發(fā)酵效率并不減弱，酵母數(shù)量過(guò)多反而生產(chǎn)效率降低，酵母數(shù)量減少，節(jié)省了產(chǎn)生RNA,DNA,蛋白質(zhì)等的NADPH， 酵母可以有更多的能量去生產(chǎn)酒精，當(dāng)然對(duì)于低濃度肉桂醛和百里香酚對(duì)酒精發(fā)酵的促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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The effect of cinnamaldehyde and thymol on no-cookprocess ethanol fermentation

WANG Xin,XU Hong-xian,ZHOU Peng,DUAN Gang*

(Genercor (China) Bio-product Co. Ltd, Wuxi 214028, China)

ABSTRACTCinnamaldehyde and Thymol have anti-microbial activity, usually used as preservative in food processing and feed additive in poultry and piglet diets. The effect of cinnamaldehyde and thymol on no-cook process ethanol production was studied. The result showed that when using rice as raw material additional cinnamaldehyde at 10ppm orthymol at 50ppm resulted in 1.7% and 0.7% ethanol yield increasing respectively; similarwith rice, when using corn as raw material, 50 ppm cinnamaldehyde and 25ppm thymolresulted in 2.0% and 1.43% ethanol yield increasing respectively; However, if further increasing concentration of cinnamaldehyde and thymol,yeast growth was inhibited and ethanol yield was decreased.

Key wordscinnamaldehyde; thymol; no-cook process; ethanol

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606017

收稿日期：2016-01-27，改回日期：2016-03-15

第一作者：碩士(段鋼博士為通訊作者，E-mail:gang.duan@dupont,com)。