董寧遠(yuǎn)，張閣元，徐沙，高曉冬

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

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來(lái)源于胞曲霉的α-1,2-甘露糖苷酶在釀酒酵母Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中的定位表達(dá)

董寧遠(yuǎn)，張閣元，徐沙，高曉冬*

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

摘要利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生產(chǎn)醫(yī)藥糖蛋白，必須對(duì)其N(xiāo)-糖基化途徑進(jìn)行人源化改造。在敲除釀酒酵母W303A特異性糖基化基因ALG3、OCH1和MNN1后，表達(dá)來(lái)源于胞曲霉(Aspergillus saitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)進(jìn)一步改造釀酒酵母N-糖鏈。通過(guò)在MsdSp的C-端添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)(HDEL)和構(gòu)建高爾基體滯留信號(hào)Kre2p與MsdSp的嵌合體蛋白實(shí)現(xiàn)MsdSp在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的定位表達(dá)。結(jié)果表明，各突變株中均檢測(cè)到Man3GlcNAc2和Man4GlcNAc2型N-糖鏈，并且在強(qiáng)啟動(dòng)子酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GPD)控制下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)MsdSp的菌株KM201中，Man3GlcNAc2和Man4GlcNAc2型N-糖鏈含量較多。該研究為釀酒酵母N-聚糖進(jìn)一步人源化改造提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞釀酒酵母；人源化；N-糖鏈結(jié)構(gòu)；細(xì)胞定位

N-糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式[1]，糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性、穩(wěn)定性，分子間的相互識(shí)別，特定的免疫反應(yīng)以及糖蛋白藥物的半衰期等方面都有重要的影響[2-3]。目前已有多種糖蛋白藥物被批準(zhǔn)用于治療人類(lèi)疾病[4]。迄今為止，生產(chǎn)醫(yī)藥糖蛋白的主要途徑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系CHO、人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞HEK等)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的優(yōu)勢(shì)在于其重組蛋白的糖基化形式為復(fù)合型、雜合型，與人類(lèi)相似。但是，基因操作復(fù)雜、外源基因不能精確定位、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題限制了哺乳動(dòng)物表達(dá)體系的應(yīng)用和發(fā)展[5]。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始嘗試在酵母等微生物中表達(dá)醫(yī)藥糖蛋白。

釀酒酵母和高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N-糖基化過(guò)程具有高度保守性[6-7]。二者均是先組裝一個(gè)多萜醇寡糖前體(Dol-PP-Glc3Man9GlcNAc2)，然后在寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OST)的催化下，將糖鏈從前體上轉(zhuǎn)移至新生肽鏈的天冬酰胺(Asn)殘基上(N-糖基化位點(diǎn)序列Asn-X-Ser/Thr)。隨后，N-糖鏈被葡萄糖苷酶(Glucosidase)和α-1,2-甘露糖苷酶(α-1,2-mannosidase，MnsI)特異性識(shí)別，切去3個(gè)葡萄糖和1個(gè)甘露糖形成Man8GlcNAc2型N-糖鏈。進(jìn)入高爾基體后，釀酒酵母和高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的N-糖基化出現(xiàn)差異。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞高爾基體中一系列甘露糖苷酶的作用下，切去5個(gè)甘露糖，形成Man3GlcNAc2糖鏈，再依次在N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I(GnTI)、N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶II(GnTII)、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)及唾液酸轉(zhuǎn)移酶(SiaT)的作用下，添加若干N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和唾液酸，形成復(fù)合型或雜合型N-糖鏈[8]。然而，在釀酒酵母高爾基體中，Man8GlcNAc2首先被α-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(Och1p)特異性識(shí)別，添加一個(gè)甘露糖。然后，在一系列糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，繼續(xù)添加幾十至幾百個(gè)甘露糖，形成高甘露糖型N-糖鏈[9-10]。因此，未經(jīng)改造的酵母生產(chǎn)的糖蛋白具有高甘露糖型糖基化修飾，不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)還會(huì)引起人體的過(guò)敏反應(yīng), 因此必須對(duì)酵母糖基化途徑進(jìn)行人源化改造[11]。早在1993年，NAKANISHI-SHINDO[12]等發(fā)現(xiàn)通過(guò)同時(shí)敲除釀酒酵母的OCH1和MNN1基因，可以消除釀酒酵母高甘露糖型N-糖基化。CHIBA[13]等同時(shí)敲除了釀酒酵母的OCH1、MNN1及MNN4基因，并成功表達(dá)了來(lái)源于胞曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶，首次在釀酒酵母中得到了人類(lèi)N-糖基化中間體Man5GlcNAc2。2004年，DAVIDSON等[14]通過(guò)敲除畢赤酵母的ALG3、OCH1基因，阻止了α-1,3-和α-1,6-甘露糖殘基連接到Man5GlcNAc2糖鏈上，并通過(guò)α-1,2-甘露糖苷酶的體外酶切處理得到了人源化過(guò)程的核心型糖鏈結(jié)構(gòu)Man3GlcNAc2。

本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母Δalg3Δoch1Δmnn1為出發(fā)菌株，通過(guò)在菌株中定位表達(dá)來(lái)源于胞曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)進(jìn)一步人源化釀酒酵母的N-聚糖。利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)HDEL或高爾基體滯留信號(hào)Kre2p實(shí)現(xiàn)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中的定位表達(dá)。MALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明重組菌中均出現(xiàn)了Man4GlcNAc2和Man3GlcNAc2型N-糖鏈，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)MsdSp的作用效果優(yōu)于高爾基體定位。此外，在酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GPD)的調(diào)控下，重組菌中Man3GlcNAc2型N-糖鏈含量有了顯著提高。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)用到菌株的名稱(chēng)及特征見(jiàn)表1。質(zhì)粒pUC57-MsdS由南京金斯瑞生物公司合成，以此為模板，可以擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽的MsdS和MsdSHDEL基因片段。以釀酒酵母W303A基因組、質(zhì)粒pTi-GFP和pTi-RFP為模板擴(kuò)增得到KRE2、GFP和RFP基因。 用BamHI-EcoRI雙酶切處理質(zhì)粒pY26和MsdSHDEL，連接得到質(zhì)粒pY26GPD-MsdSHDEL。再用SalI-XhoI處理質(zhì)粒pY26GPD-MsdSHDEL和GFP基因，得到pY26GPD-GFP-MsdSHDEL質(zhì)粒。依次對(duì)pRS424TEF質(zhì)粒和KRE2、MsdS、GFP基因進(jìn)行BamHI-SmaI、SmaI-SalI、SalI-XhoI雙酶切處理，依次連接后得到質(zhì)粒pRS424TEF-Kre2-MsdS-GFP。依次對(duì)pRS425TEF質(zhì)粒和KRE2、RFP基因進(jìn)行BamHI-SmaI、SmaI-PstI雙酶切處理，再依次連接得到質(zhì)粒pRS425TEF-Kre2-RFP。本實(shí)驗(yàn)用到的PCR引物和構(gòu)建的質(zhì)粒見(jiàn)表2和表3。

表1　菌株

1.1.2主要試劑與儀器

各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶及N-糖苷酶F(PNGase F)試劑盒，大連寶生物公司；PCR引物及PCR產(chǎn)物純化試劑盒，上海生物工程公司；PCR儀，日本TaKaRa公司；移液槍?zhuān)聡?guó)Eppendorf公司；熒光倒置顯微鏡，日本Nikon。

1.1.3培養(yǎng)基配方

(1) 2×YT液體培養(yǎng)基：每升含酵母提取物10 g，蛋白胨16 g，NaCl 5 g；(2) YPAD液體培養(yǎng)基：每升含蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，腺嘌呤30 mg；(3) SD選擇培養(yǎng)基：每升含酵母氮源基礎(chǔ)6.7 g，葡萄糖20 g，滅菌后加入相應(yīng)氨基酸缺陷型粉末；配制對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基需加入20 g/L的瓊脂粉。配制含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，氨芐需在培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右加入，終質(zhì)量濃度為0.1 g/L。含5-氟乳清酸(5-FOA)的培養(yǎng)基，終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，在60 ℃左右加入，60 ℃攪拌約1 h，至5-FOA完全溶解。

1.2熒光顯微鏡分析

從平板上挑取單菌落，接種于3 mL的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期。離心收集細(xì)胞，用去離子水反復(fù)清洗2次，并用100 μL去離子水重懸。取5 μL的菌液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于熒光倒置顯微鏡上。選擇合適的放大倍數(shù)和光源，用圖像分析軟件NIS-Element AR觀察分析。

1.3細(xì)胞壁甘露糖蛋白中N-糖鏈的提取

挑取單菌落于100 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d左右，離心收集細(xì)胞。用去離子水清洗細(xì)胞后，加入適量100 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH=7.0)重懸。121 ℃處理2 h，離心收集上清液，加入3倍體積的冰乙醇，充分混勻，室溫靜置30 min。離心棄上清液，并用70%的乙醇清洗2次，將獲得的沉淀真空干燥，稱(chēng)重。然后用適量的去離子水溶解，使蛋白溶液質(zhì)量濃度約為100 g/L。取20 μL糖蛋白溶液，加入適量緩沖液，用2 μL的PNGase F在37 ℃處理12～16 h。用Supelclean ENVI-Carb Cartridges填料的柱子純化釋放的N-糖鏈，冷凍干燥，-20 ℃保存。

1.4質(zhì)譜分析

PA化糖鏈用纖維素石墨碳柱(Cellulose Cartridge Column)純化處理，具體方法見(jiàn)Pyridylamination Manual Kit (Takara Code:D4480)說(shuō)明書(shū)。先取1 μL PA化糖鏈溶液于不銹鋼樣品靶板表面，置于室溫下干燥，再取1 μL 龍膽酸(2,5-二羥基苯甲酸，2,5-dihydroxy-benzoic acid,DHB)基質(zhì)溶液于干燥后的氨基吡啶糖鏈化合物樣品表面，室溫下干燥結(jié)晶。

質(zhì)譜分析條件：質(zhì)譜儀：Bruker Daltonics ultrafleXtreme；控制軟件：FlexControl；分析軟件：FlexAnalysis versison 3.3；方法：RP700-3500 (reflective mode， positive) Smartbeam II(modified Nd:YAG laser),337 nm氮分子激光器。

表2　引物

注：酶切位點(diǎn)加粗表示；同源臂序列添加下劃線。

表3　質(zhì)粒

GPD:酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子; GFP/RFP:綠色/紅色熒光蛋白基因。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1α-1,2-甘露糖苷酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位表達(dá)

利用HDEL序列(His-Asp-Glu-Leu)可以實(shí)現(xiàn)α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)在菌株內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位表達(dá)。HDEL序列是釀酒酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，C-端含HDEL信號(hào)肽的蛋白會(huì)被從高爾基體中轉(zhuǎn)運(yùn)回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位表達(dá)[16-17]。本研究以合成的MsdS基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增無(wú)信號(hào)肽且C-端添加HDEL信號(hào)的基因片段MsdSHDEL(如圖1-a所示)，并在其N(xiāo)-端連接綠色熒光蛋白(GFP)，得到GFP-MsdSHDEL基因片段。將GFP-MsdSHDEL基因片段和由酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶強(qiáng)啟動(dòng)子(GPD)控制的GPDpr-GFP-MsdSHDEL基因片段在菌株KM(Δalg3::URA3)基因組中ALG3開(kāi)放式閱讀框位置進(jìn)行表達(dá)。

設(shè)計(jì)同時(shí)具有ALG3基因上游或下游50 bp同源臂序列和GFP-MsdSHDEL基因5’端或3’端序列的引物F6/R6。以質(zhì)粒pY26GPD-GFP-MsdSHDEL為模板，以F6/R6為引物，擴(kuò)增得到帶有ALG3開(kāi)放閱讀框上下游各50 bp同源臂的基因片段，通過(guò)線性DNA醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入KM菌株，涂布在YPAD平板上預(yù)培養(yǎng)，再影印到SD全培養(yǎng)基(含5-FOA)上。挑取轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)并提取基因組，以F7/R7為引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1-b所示(F7在ALG3上游設(shè)計(jì)取得，R7在GFP-MsdSHDEL片段500 bp左右設(shè)計(jì)取得)。對(duì)照組無(wú)條帶，轉(zhuǎn)化子有條帶且長(zhǎng)度為500 bp，證明作者得到了GFP-MsdSHDEL整合于酵母染色體基因組的菌株KM101(如圖2所示)。采用相似的構(gòu)建方法，得到GPDpr-GFP-MsdSHDEL基因在酵母染色體基因組整合表達(dá)的菌株KM201。

a-MsdSHDEL基因條帶；b-GFP-MsdSHDEL陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證圖1　GFP-MsdSHDEL基因片段在菌株KM中的整合表達(dá)Fig.1　Integrative expression of GFP-MsdSHDEL in KM strain(a. PCRamplification results of the MsdSHDEL gene. M: marker; 1: MsdSHDEL gene；b. Integrative expression of GFP-MsdSHDEL gene was confirmed by genome PCR. M: marker; 1: negative control; 2: positive transformants)

a-SD全培養(yǎng)基; b0SD培養(yǎng)基缺URA圖2　URA3的敲除及GFP-MsdSHDEL基因的整合型表達(dá)Fig.2　The rescue of URA3(ALG3) marker and integrative expression of GFP-MsdSHDEL gene

同時(shí)將質(zhì)粒pRS305GAPⅡ-RFPHDEL通過(guò)線性轉(zhuǎn)化整合到菌株KM101基因組中，用于GFP-MsdSHDEL的熒光定位觀察，結(jié)果如圖3所示。在酵母細(xì)胞膜周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中均檢測(cè)到綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白，且二者位置吻合。證實(shí)了在菌株KM101中α-1,2-甘露糖苷酶定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)。

左：綠色熒光激發(fā)；中：紅色熒光激發(fā)；右：重疊處理圖3　α-1,2甘露糖苷酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達(dá)的熒光分析Fig.3　ER localization of MsdSp analyzed by fluorescence microscopy

2.2α-1,2-甘露糖苷酶在高爾基體的定位表達(dá)

釀酒酵母Kre2p(α-1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶)是高爾基體滯留的II型跨膜蛋白，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞質(zhì)一側(cè)較短的N-端區(qū)域及跨膜域起到了高爾基體定位的作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)側(cè)的C-端區(qū)域則為蛋白活性催化區(qū)域[18]。因此，可以利用嵌合體蛋白Kre2-MsdS-GFP實(shí)現(xiàn)α-1,2-甘露糖苷酶在菌株高爾基體中的定位表達(dá)。通過(guò)融合PCR將去信號(hào)肽的MsdS基因與KRE2基因N-端部分(前300bp)及GFP基因整合起來(lái)，得到pRS424TEF-Kre2-MsdS-GFP質(zhì)粒，并通過(guò)一步轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入Δalg3Δoch1Δmnn1菌株。為了對(duì)Kre2-MsdS-GFP嵌合體蛋白的高爾基體定位表達(dá)效果進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)在Δalg3Δoch1Δmnn1菌株中表達(dá)pRS424TEF-Kre2-MsdS-GFP和pRS424TEF-Kre2-RFP質(zhì)粒，得到菌株KG101，并對(duì)其進(jìn)行熒光顯微鏡分析，結(jié)果如圖4所示。

左：紅色熒光激發(fā)；中：綠色熒光激發(fā)；右：重疊處理圖4　α-1,2甘露糖苷酶高爾基體定位表達(dá)的熒光分析Fig. 4　Golgi localization of MsdSp analyzed by fluorescence microscopy

不論用綠色熒光激發(fā)還是紅色熒光激發(fā)KG101菌株胞內(nèi)都存在明顯的呈不規(guī)則點(diǎn)狀分布的熒光蛋白。對(duì)紅綠熒光進(jìn)行重疊處理后發(fā)現(xiàn)，綠色熒光和紅色熒光所在的位置完全吻合，表明在KG101菌株中，Kre2-MsdS-GFP嵌合體蛋白被定位于高爾基體中表達(dá)。

2.3N-糖鏈結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜分析

為了檢測(cè)各種表達(dá)方式中α-1,2-甘露糖苷酶的作用效果，作者采用MALDI-TOF-MS對(duì)N-糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5所示。除了Man5GlcNAc2(m/z=1335)和Man6GlcNAc2(m/z=1497)兩種N-糖鏈以外，菌株中均存在質(zhì)荷比(m/z)為1 013和1 175的峰。根據(jù)Glyco Workbench軟件分析，質(zhì)荷比(m/z)為1013的峰對(duì)應(yīng)的N-糖鏈結(jié)構(gòu)為Man3GlcNAc2，質(zhì)荷比(m/z)為1 175的峰對(duì)應(yīng)的N-糖鏈結(jié)構(gòu)為Man4GlcNAc2。這說(shuō)明3種菌株中表達(dá)的α-1,2-甘露糖苷酶都起到了一定的作用，能將Man5GlcNAc2型N-糖鏈進(jìn)一步酶切得到酵母人源化核心N-糖鏈結(jié)構(gòu)Man3GlcNAc2。此外，對(duì)比KM101、KM201和KG101菌株的質(zhì)譜分析結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，菌株KG101中Man3GlcNAc2型N-糖鏈所占的比例最低，說(shuō)明高爾基體中定位表達(dá)的α-1,2-甘露糖苷酶的作用效果不如在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中定位表達(dá)的α-1,2-甘露糖苷酶的作用效果。而且，同樣是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中定位表達(dá)，含有強(qiáng)啟動(dòng)子GPDpr的菌株KM201中Man3GlcNAc2型N-糖鏈所占的比例明顯高于KM101菌株，說(shuō)明強(qiáng)啟動(dòng)子增加了α-1,2-甘露糖苷酶的表達(dá)量進(jìn)而增強(qiáng)了其酶切效果。

A:菌株KM101N-糖鏈的質(zhì)譜分析; B:菌株KM201 N-糖鏈的質(zhì)譜分析; C:菌株KG101 N-糖鏈的質(zhì)譜分析圖5　菌株細(xì)胞壁糖蛋白N-糖鏈的質(zhì)譜分析Fig.5　MALDI-TOF-MS analysis of the cell wall N-glycans

3討論

N-糖基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性至關(guān)重要，某些特定的糖鏈結(jié)構(gòu)會(huì)參與一些免疫反應(yīng)[3]。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞株可以生產(chǎn)含特定N-糖鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，進(jìn)而研究糖鏈結(jié)構(gòu)與蛋白活性的關(guān)系，幫助構(gòu)建糖蛋白文庫(kù)。但是即便得到糖蛋白的最佳結(jié)構(gòu)，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件要求高、表達(dá)量低等缺陷，限制了糖蛋白的批量生產(chǎn)。酵母發(fā)酵工藝的研究比較成熟，酵母細(xì)胞生長(zhǎng)快，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，用酵母細(xì)胞批量生產(chǎn)糖蛋白具有一定的優(yōu)勢(shì)。

不同的酵母菌株N-糖基化途徑的改造存在一定差異性?；舅悸范际窍认湍缸陨淼母吒事短腔?，再構(gòu)建人源化的糖基化途徑。作者在前期研究中，通過(guò)構(gòu)建Δalg3Δoch1Δmnn1菌株，獲得均一的Man5GlcNAc2N-糖鏈[15]。再分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體中定為表達(dá)來(lái)源于胞曲霉(Aspergillussaitoi)的α-1,2-甘露糖苷酶(MsdSp)，使重組菌中N-聚糖出現(xiàn)Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)，并且通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子GPDpr的調(diào)控，增加了Man3GlcNAc2型N-糖鏈所占比例。但是最終菌株仍存在糖鏈結(jié)構(gòu)不均一的問(wèn)題，為進(jìn)一步的改造帶來(lái)了困難，這也是酵母人源化表達(dá)體系構(gòu)建中存在的普遍問(wèn)題。HAMILTON[19]等在對(duì)畢赤酵母的改造中也遇到過(guò)相同問(wèn)題。因此仍需通過(guò)進(jìn)一步的研究以得到均一的Man3GlcNAc2N-糖鏈。在今后的研究中，作者將進(jìn)一步在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中定位表達(dá)來(lái)源于人和其他生物的α-1,2-甘露糖苷酶，以期得到高純度的Man3GlcNAc2型N-糖鏈。

參考文獻(xiàn)

[1]VARKI A.Biological roles of oligosaccharides:all of the theories are correct[J].Glycobiology,1993,3(2):97-130.

[2]COLOMA M J,TRINH R K,MARTINEZ A R,et al.Position effects of variable region carbohydrate on the affinity and in vivo behavior of an anti-(1→6) dextran antibody[J].The Journal of Immunology,1999,162(4):2 162-2 170.

[3]MURAMATSU T.Essential roles of carbohydrate signals in development, immune response and tissue functions,as revealed by gene targeting[J].Journal of Biochemistry,2000,127(2):171-176.

[4]SETHURAMAN N,STADHEIM T A.Challenges in therapeutic glycoprotein production[J].Current opinion in biotechnology,2006, 17(4):341-346.

[5]徐沙,中西秀樹(shù),高曉冬.糖蛋白藥物表達(dá)系統(tǒng)糖基化研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(3):221-229.

[6]BURDA P,ABI M.The dolichol pathway ofN-linked glycosylation[J].Biochimica et Biophysica Acta,1999,1 426(2):239-257.

[7]WILDT S,GERNGROSS T U.The humanization ofN-glycosylation pathways in yeast[J].Microbiology,2005,2(3):119-128.

[8]HAMILTON S R,DAVIDSON R C,SETHURAMAN N,et al.Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins[J]. Science,2006,313(5 792):1 441-1 443.

[9]YIP C L,WELCH S K,KLEBL F,et al.Cloning and analysis of theSaccharomycescerevisiaeMNN9 and MNN1 genes required for complex glycosylation of secreted proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1994,91(7):2 723-2 727.

[10]GRAHAM T R,EMRS D,Compartmental organization of Golgi-specific protein modification and vacuolar protein sorting events defined in a yeast sec18(NSF) mutant[J].Journal of Cell Biology,1991,114(2):207-218.

[11]GERNGROSS T U.Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi[J].Nature biotechnology,2004,22(11): 1 409-1 414.

[12]NAKANISHI-SHINDO Y,NAKAYAMA K,TANAKA A,TODA Y,JIGAMI Y.Structure ofN-linked oligosaccharides that show the complete loss of alpha-1,6-polymannose outer chain fromoch1,och1mnn1,andoch1mnn1alg3 mutants ofSaccharomycescerevisiae[J].Journal of Biological chemistry, 1993,268(35):26 338-26 345.

[13]CHIBA Y,SUZUKI M,YOSHIDA S,et al.Production of human compatible high mannose -type (Man5GlcNAc2) sugar chains inSaccharomycescerevisiae[J].Journal of Biological chemistry,1998,273(41):26 298-26 304.

[14]DAVIDSON R C,NETT J H, RENFER E,et al.Functional analysis of theALG3 gene encoding the Dol-P-Man: Man5GlcNAc2-PP-Dol mannosyl -transferase enzyme ofP.pastoris[J].Glycobiology,2004,14(5):399-407.

[15]賀鐵凡,徐沙,張閣元,等.重構(gòu)釀酒酵母N-糖基化途徑生產(chǎn)人源化糖蛋白[J].微生物學(xué)報(bào),2014,54(5):509-516.

[16]VERVECKEN W, KAIGORODOV V,CALLEWAERT N,et al.InVivosynthesis of mammalian-like, hybrid-typeN-glycans inPichiapastoris[J]. Applied and Environmental Microbiology,2004,70(5):2 639-2 646.

[17]王克夷.蛋白質(zhì)的翻譯后加工-蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)[J].生命的化學(xué),1995,15(3):1-4.

[18]LUSSIER M,SDICU A-M,KETELA T,et al.Localization and targeting of theSaccharomycescerevisiaeKre2p/Mnt1p alpha 1,2-mannosyltransferase to a medial-Golgi compartment[J].The Journal of Cell Biology,1995,131(4): 913-927.

[19]HAMILTON S R,PIOTR B,BEATA B,et al.Production of complex human glycoproteins in yeast[J].Science,2003,301(5637):1 243-1 246.

Expression of α-1,2-mannosidase fromAspergillussaitoiinSaccharomycescerevisiaeΔalg3Δoch1Δmnn1 mutant

DONG Ning-yuan，ZHANG Ge-yuan，XU Sha，GAO Xiao-dong*

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

ABSTRACTYeast N-glycosylation pathway was engineered to produce humanized glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae. After knocking out of ALG3, OCH1 and MNN1 genes, α-1,2-mannosidase from Aspergillus saitoi (MsdSp) was expressed in Saccharomyces cerevisiae for further humanization of N-glycosylation. Addition of HDEL at C-terminal of MsdSp and construction of Kre2p and MsdSp chimeric protein contributed to ER and Golgi localization. The MALDI-TOF-MS results demonstrated that strain KM201 (with GPDpr-msdsHDEL in the genome) produced more Man3GlcNAc2N-glycans. This research facilitates the humanization of N-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae.To produce humanized glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae, yeast N-glycosylation pathway has to be engineered. After knocking out of ALG3, OCH1 and MNN1 genes, α-1,2-mannosidase from Aspergillus saitoi (MsdSp) was expressed in Saccharomyces cerevisiae for further humanization of N-glycosylation. Addition of HDEL at C-terminal of MsdSp and construction of Kre2p and MsdSp chimeric protein contributed to ER and Golgi localization. The MALDI-TOF-MS results demonstrated that strain KM201(with GPDpr-msdsHDEL in the genome) produced more Man3GlcNAc2N-glycans. This research facilitates the humanization of N-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae.

Key wordsyeast; humanization; N-glycan; localization

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606001

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(21406087)

收稿日期：2015-12-31，改回日期：2016-03-12

第一作者：碩士研究生(高曉冬教授為通訊作者,E-mail:xdgao@jiangnan.edu.cn)。