許亞寧，張　輝，肖　瑤

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·專題綜述·

CD4/CD45雙色單平臺法檢測HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞研究進(jìn)展

許亞寧，張輝，肖瑤

［摘要］CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)是評價AIDS疾病進(jìn)展和抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。本文介紹了流式細(xì)胞儀CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)方法的發(fā)展歷史。將CD4/CD45雙色單平臺法的準(zhǔn)確性、可靠性和經(jīng)濟(jì)性與其他方法進(jìn)行了比較。表明該法簡便、廉價且實用性強(qiáng)。同時介紹了當(dāng)前適用于CD4/CD45雙色單平臺法的幾款流式細(xì)胞儀的機(jī)型特點。

［關(guān)鍵詞］HIV；CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)；抗原，CD45；流式細(xì)胞術(shù)

DOI∶ 10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.014

HIV感染引起的AIDS是世界性公共健康問題［1］。根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention， CDC）2015年調(diào)查統(tǒng)計，世界約有3690萬人攜帶HIV，累計約有7600萬人感染HIV，3900萬人死于AIDS，僅2014年死亡人數(shù)就超過120萬人［2］。HIV感染的典型特征是CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，T淋巴細(xì)胞功能受損和機(jī)體免疫功能缺陷。2014年5月更新的《HIV-1感染的成年人和青少年的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物使用指南》中將CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)作為AIDS檢測的重要標(biāo)準(zhǔn)。一直以來，研究人員使用傳統(tǒng)的雙平臺三色以上熒光抗體染色法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)，但是這些方法檢測費用昂貴，對實驗室設(shè)備、人員和檢測樣本要求較高，不適宜進(jìn)行高通量的HIV檢測。隨著科技的發(fā)展，新興的CD4/CD45雙色流式細(xì)胞儀單平臺法檢測CD4+T淋巴細(xì)胞不僅操作簡單，價格低廉，而且準(zhǔn)確性高，能夠作為標(biāo)準(zhǔn)方法廣泛推廣。

1　CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)的發(fā)展

CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)始于20世紀(jì)90年代，采用雙平臺法，使用血液分析儀檢測淋巴細(xì)胞總數(shù)，使用流式細(xì)胞儀CD3/CD4或CD3/CD4/CD45抗體檢測CD4+T淋巴細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞百分比，由此計算出CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)［3］。1996年O’Gorman和Gelman［4］提出使用流式細(xì)胞儀單平臺法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)。單平臺法是指通過一臺流式細(xì)胞儀直接檢測淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)量，計數(shù)原理包括直接體積計數(shù)、內(nèi)參照微球計數(shù)、毛細(xì)管計數(shù)、阻抗法計數(shù)和推進(jìn)器容積計數(shù)等，但由于技術(shù)手段問題，淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性略顯不足。鑒于各種方法的不統(tǒng)一性，1997年美國CDC更新CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)指導(dǎo)方針，推薦用雙平臺法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)［5］。此法不足之處在于：①不同操作者和不同操作方式得出不同的淋巴細(xì)胞計數(shù)結(jié)果；②無法進(jìn)行兩臺設(shè)備間的質(zhì)控和室間質(zhì)控；③血液分析儀中的淋巴細(xì)胞定義有異于流式細(xì)胞儀中的淋巴細(xì)胞，造成系統(tǒng)差異；④多種抗體和消耗品的使用導(dǎo)致成本偏高。2002年Glencross等［6］提出CD4/CD45雙色法：使用CD45輔助白細(xì)胞設(shè)門法，基于白細(xì)胞而不是單純的淋巴細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，由血液分析儀的白細(xì)胞絕對計數(shù)和流式細(xì)胞儀的CD4+T淋巴細(xì)胞相對計數(shù)計算出CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量。隨后，加拿大CDC于2003年頒布了單平臺CD45輔助白細(xì)胞設(shè)門法的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)指導(dǎo)方針，對雙色單平臺法進(jìn)行詳述和推薦［7］。至此，CD4/CD45雙色單平臺法測定CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)趨于成熟穩(wěn)定。

CD4/CD45雙色單平臺法通過設(shè)門的方法測定CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)和相對計數(shù)。首先，在CD45/SSC（side scatter，側(cè)向角散射）散點圖中調(diào)整SSC和CD45（圖1），使所有白細(xì)胞群均可見，并圈定白細(xì)胞群（R3），其次，根據(jù)白細(xì)胞群（R3）設(shè)門再設(shè)定CD4/SSC散點圖，通過設(shè)門將表達(dá)CD4的陽性淋巴細(xì)胞亞群（R1）和CD4陰性淋巴細(xì)胞亞群（R2）進(jìn)行區(qū)分，CD4弱表達(dá)的單核細(xì)胞干擾可通過其在SSC坐標(biāo)的位置進(jìn)行區(qū)分，并通過修改SSC坐標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)由R1得出，CD4細(xì)胞相對計數(shù)為CD4+/CD45+比值，也叫做CD4+T淋巴細(xì)胞相對計數(shù)百分率［8］。

圖1　CD4/CD45雙色單平臺法CD4+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)Figure 1 CD4/CD45 two-color single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration

2　單平臺雙色和多色免疫分型的比較

許多指導(dǎo)手冊提出，使用流式細(xì)胞儀對HIV感染者進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)必須加強(qiáng)質(zhì)量控制，增強(qiáng)數(shù)據(jù)可靠性［9］。策略包括增加CD3抗體的使用，同時具有CD4和CD3雙陽性的淋巴細(xì)胞，才被認(rèn)為是有指導(dǎo)意義的輔助性T淋巴細(xì)胞。美國國家過敏和傳染病研究所AIDS分所建議使用多色抗體組合的方法，例如使用CD3/CD4確定T淋巴細(xì)胞/輔助性T淋巴細(xì)胞群；使用CD3/CD8確定T淋巴細(xì)胞/抑制性T淋巴細(xì)胞群。在多色抗體組合方案中對CD3陽性細(xì)胞的重復(fù)性有要求，重復(fù)結(jié)果差異應(yīng)≤3％，如果＞3％，說明樣本的管間變異較大，建議重新檢測此樣本。一般來講，成年人外周血中CD4+CD3+T淋巴細(xì)胞和CD8+CD3+T淋巴細(xì)胞百分比的總和應(yīng)該等于CD3+T淋巴細(xì)胞的百分比，變化范圍為5％～10％，如果超出此變化范圍，須要考慮其他因素，例如樣本中可能大量存在異常T淋巴細(xì)胞亞群。

CD4/CD45雙色法建立之初，關(guān)于HIV感染者中CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)采用雙色法或多色法分析具有爭議，CD4/CD45法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性成為研究內(nèi)容。Pattanapanyasat等［10］對611例HIV感染者樣本使用CD4/CD45雙色和CD3/CD4 /CD45三色法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)，2種方法的CD4+T淋巴細(xì)胞相對計數(shù)差異為0.03％。與三色法相比，雙色法檢測成本由12美元降低至2.5美元。Sippy-Chatrani 等［11］使用150例HIV感染者血液樣本比較CD4/CD45雙色法與CD3/CD4/CD8/CD45四色法CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)。結(jié)果表明，2種方法測量所得CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)和相對計數(shù)具有高度一致性（r2=0.95、0.98），無顯著偏差，測試成本由25美元節(jié)約至8美元。由于操作簡便，對研究人員技術(shù)要求低，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性高以及成本低廉，CD4/CD45雙色法不再局限于資源緊張或者疾病的高發(fā)地區(qū)，逐漸引起廣泛的關(guān)注。2008年Denny等［12］使用不同品牌流式細(xì)胞儀對99 例HIV感染者樣本進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)檢測，用以評估CD4/CD45雙色法與四色法的精確性。研究表明，CD4/CD45雙色法數(shù)據(jù)一致性和精確性均高于傳統(tǒng)的四色法。推薦所有臨床和科研機(jī)構(gòu)，特別是進(jìn)行大批量樣本處理的機(jī)構(gòu)，使用此方法提高實驗數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性。與此同時，我國學(xué)者也對CD4/CD45法進(jìn)行評估，旨在評價樣本采集后不同放置時間是否影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。結(jié)果表明CD4/CD45法簡便準(zhǔn)確、重復(fù)性好、誤差小，對于陳舊樣本（采集后不超過6 d）的分析有獨到的優(yōu)勢［13］。CD4/CD45雙色法與多色法在CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)檢測方面具有較高的一致性，而且大大降低測試成本，尤其適合我國國情。

3　CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)單平臺法與雙平臺法的比較

與傳統(tǒng)的雙平臺CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)法相比，CD4/CD45單平臺法自創(chuàng)建起就備受爭議。1999 年Barnett等［14］使用三種單平臺系統(tǒng)（FlowCount/ Beckman Coulter、 TruCount/Becton Dickinson、CytoronAbsolute/Ortho Clinical Diagnostics）進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)檢測，并與CD4/CD45雙平臺法進(jìn)行比較。對于固定血液樣本，單平臺法的相關(guān)性優(yōu)于雙平臺法（CV值分別為13.7％和23.4％），出于對實驗重復(fù)性的考慮，作者建議使用單平臺法。文章指出，使用計數(shù)微球進(jìn)行體積測定的操作中，不同的操作手法會造成較大差異性，某些材質(zhì)的計數(shù)微球也會由于形成多聚體造成結(jié)果偏差。2002年，Glencross等［15］使用CD4/CD45雙色雙平臺和單平臺法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法的CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)具有良好的一致性（r=0.94），單平臺體積法和微球法不僅具有高度準(zhǔn)確性，而且可以進(jìn)行內(nèi)部控制和外部控制，能夠作為標(biāo)準(zhǔn)的CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)檢測方法進(jìn)行使用。同年，Janossy 等［16］使用單平臺體積法和微球法對600例樣本進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)。與雙平臺法比，2種單平臺法均保證了結(jié)果的準(zhǔn)確度，并可降低93％的試劑成本。2006年，Karcher等［17］使用兩種單平臺法［Cyto-Spheres /Beckman Coulter和 CyFlow Counter/Partec （CD4/CD45）］進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)檢測，并與雙平臺雙色法（FACScan/ Becton Dickinson）進(jìn)行比較。結(jié)果證明，使用絕對體積真實計數(shù)的CyFlow Counter避免了CytoSpheres使用計數(shù)微球造成的誤差，在準(zhǔn)確度和相關(guān)性上，CyFlow Counter均比CytoSpheres效果好（r = 0.929、0.725）。此外，CyFlow Counter由于價格低廉（1.75～2.00歐元/樣本），操作簡單，結(jié)果快速（10樣本/h），尤為推薦在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)使用。隨著科技發(fā)展，單平臺法以其簡便的操作，高度的準(zhǔn)確性和一致性，已經(jīng)逐漸替代雙平臺法成為主要的CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)檢測方法。

4　目前采用單平臺法CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)常用機(jī)型

隨著科技的發(fā)展，許多商業(yè)化的單平臺技術(shù)被大力研發(fā)和廣泛使用，表1例舉了一些常見的可使用CD4/CD45法的流式細(xì)胞儀品牌機(jī)型。以下選取部分代表性機(jī)型進(jìn)行討論。 CyFlow Counter 和CyFlow miniPOC（Point of Care）是由德國Partec公司生產(chǎn)的桌面式流式細(xì)胞儀，配備有532 nm的綠色固態(tài)激光，3個光學(xué)信號通道，可使用CD4/ CD45雙色法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)［18］。系統(tǒng)使用機(jī)械方法進(jìn)行體積測量，省去微球的使用直接計算進(jìn)樣體積，減少任何與微球濃度變化相關(guān)的誤差。由于系統(tǒng)精準(zhǔn)性較高，對操作者技術(shù)要求較低，適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)或者患者分散地區(qū)，每日最大檢測量為400個樣本。FACSCalibur是Becton Dickinson為常規(guī)免疫表型分析所研制的一款流式細(xì)胞儀，儀器最多可配備488 nm藍(lán)色和635 nm紅色氣態(tài)激光，可使用CD4/CD45設(shè)門法和微球計數(shù)法對CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)［19］。樣本制備至檢測需要1 h左右，對實驗技術(shù)要求低，適用于每日樣本量小于50的實驗室。Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀是Beckman Coulter研制的產(chǎn)品，配備488 nm藍(lán)色激光器，可檢測5種熒光通道［20］。儀器可使用CD4/CD45設(shè)門法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)，通過微球法進(jìn)行體積定量。樣本檢測需100 μl全血，樣本準(zhǔn)備需1 h左右。EPICS XL流式細(xì)胞儀是Beckman Coulter的產(chǎn)品，最多檢測四色熒光，配合使用計數(shù)微球和相關(guān)抗體可檢測CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)。BriCyte E6系統(tǒng)是邁瑞公司研發(fā)的中國第一款流式細(xì)胞儀，其配備488 nm藍(lán)色激光和638 nm紅色激光，可檢測6種熒光通道。使用計數(shù)微球和CD4/CD45設(shè)門法進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)檢測。由于體積較大，不便于搬運攜行，適合高通量樣本檢測的醫(yī)療科研機(jī)構(gòu)，并須配備專業(yè)操作人員。

5　展　　望

我國自1985年發(fā)現(xiàn)首例AIDS患者以來，HIV/ AIDS在我國已經(jīng)歷傳入期和局部流行期，進(jìn)入了快速增長期，并且正由高危人群向一般人群傳播，HIV未能確診及晚期診斷是目前我國存在的典型問題。診斷時，外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)是預(yù)測短期和長期病死率的一項強(qiáng)有力的指標(biāo)，目前由于我國大部分病例處于農(nóng)村和邊遠(yuǎn)地區(qū)，離體24 h內(nèi)的新鮮標(biāo)本較難得到［21-22］，為CD4+T淋巴細(xì)胞檢測提出挑戰(zhàn)。CD4/CD45法采用基于白細(xì)胞的設(shè)門方案，利用CD4、CD45 和側(cè)向散射光3個參數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞亞群免疫表型分析， 避免了傳統(tǒng)方法中根據(jù)淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)和CD4+T淋巴細(xì)胞相對計數(shù)確定CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量時淋巴細(xì)胞這一關(guān)鍵因素不易質(zhì)控的棘手問題，同時提高了長距離運輸及長時間放置樣本檢測結(jié)果的可靠性。因此，CD4/CD45法對HIV感染人群， 尤其是農(nóng)村和邊遠(yuǎn)地區(qū)HIV感染人群，在疾病病程監(jiān)控、治療以及療效評價等方面具有較高的應(yīng)用價值。

表1　CD4/CD45單平臺CD4+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)不同系統(tǒng)Table 1 Different brands for flow cytometry using single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration

綜上所述，CD4/CD45單平臺法檢測HIV感染者的CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)方法簡便、經(jīng)濟(jì)、適用性強(qiáng)［23］，有助于了解機(jī)體的免疫狀態(tài)以確定疾病分期、檢測疾病進(jìn)程、評估疾病預(yù)后以及評估抗病毒治療療程等，能夠作為我國臨床檢測技術(shù)進(jìn)行推廣。

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（2015-10-14 收稿 2015-11-08 修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 盧福昱）

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］［中國圖書資料分類號］ R392.12；R512.91 A

［文章編號］1007-8134（2016）03-0176-05

*Corresponding author， E-mail： xiaoyao@chinaaids.cn

［作者單位］730000 蘭州，甘肅省疾病預(yù)防控制中心（許亞寧）；102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心（張輝、肖瑤）

［通訊作者］肖瑤， E-mail∶ xiaoyao@chinaaids.cn

Research advances in CD4+T lymphocyte enumeration using two-color CD4/CD45 single-platform protocol in HIV-infected patients

XU Ya-ning， ZHANG Hui， XIAO Yao*
Gansu Center for Disease Control and Prevention， Lanzhou， Gansu 730000， China

［Abstract］CD4+T lymphocyte count is regarded as a major marker for evaluating disease progression and antiretroviral therapy efficacy in HIV-infected individuals. In this review， the authors introduce the development of CD4+T lymphocyte enumeration using flow cytometry， and compare CD4/CD45 two-color single-platform protocol with other protocols in terms of accuracy， reliability and economics. CD4/CD45 two-color single-platform protocol is considered to be convenience， cheap and practical. In addition， the authors introduce specific characteristics and performance of various kinds of flow cytometers using CD4/CD45 two-color single-platform protocol for CD4+T lymphocyte enumeration.

［Key words］HIV； CD4 lymphocyte count； antigens， CD45； flow cytometry