張曉珣，王 俊，趙 宇，張景耀，李 傲（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

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牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的治療作用

張曉珣，王 俊，趙 宇，張景耀，李 傲
（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

摘要：目的 研究牛蒡子苷元（ATG）對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的防治作用及可能的作用機(jī)制。方法 成年Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、ATG 3.0 mg·kg-1、CCl4模型組、CCl4+ATG 1.0和3.0 mg·kg-1組和CCl4+秋水仙堿（COL）0.1 mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組，采用sc的方法復(fù)制大鼠CCl4肝纖維化模型，造模8周。從第5周開(kāi)始，ig給予ATG和COL，連續(xù)治療4周。測(cè)定各組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性以及白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBIL）的水平，肝組織中羥脯氨酸（HYP）的含量；HE和Masson染色觀察肝組織病理改變，并采用組織免疫熒光法檢測(cè)活化的肝星狀細(xì)胞增殖，Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與CCl4模型組比較，ATG 1.0和3.0 mg·kg-1可顯著升高纖維化大鼠血清中ALB含量（P＜0.05），降低血清中GPT，AST和TBIL水平（P＜0.05），從而降低肝損傷的程度；ATG 1.0和3.0 mg·kg-1還能顯著降低纖維化大鼠肝組織中HYP的含量（P＜0.05），減少肝內(nèi)纖維組織的形成。同時(shí)，ATG 1.0和3.0 mg·kg-1還能抑制纖維化大鼠肝組織中活化的HSC增殖，顯著降低細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）2和4及增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)上調(diào)細(xì)胞周期阻抑物蛋白p27kip1的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論 ATG對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化具有顯著的治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制活化的HSC增殖相關(guān)。

關(guān)鍵詞：牛蒡子苷元；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；細(xì)胞周期

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.01.008

肝纖維化系肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過(guò)度增生與異常沉積所致肝結(jié)構(gòu)和（或）功能異常改變的一種病理變化，是多種類型細(xì)胞、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等一系列復(fù)雜作用的結(jié)果。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬變，甚至向肝癌發(fā)展所必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)。雖然肝中多種細(xì)胞參與了肝纖維化的形成，但近來(lái)國(guó)內(nèi)外取得廣泛共識(shí)的是，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）為產(chǎn)生膠原纖維和其他非膠原纖維基質(zhì)蛋白的主要來(lái)源。當(dāng)肝受到損傷后，HSC被激活，活化的HSC大量增殖，合成并分泌大量的ECM。同時(shí)，HSC高表達(dá)組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibi-tors of metalloproteinases），降低膠原酶的活性，造成膠原降解障礙，ECM大量沉積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［1-3］。近年來(lái)的研究表明，肝纖維化，甚至肝硬變?cè)缙诙伎赡孓D(zhuǎn)，而逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵在于減少活化HSC的數(shù)量［4］。

牛蒡子來(lái)源于菊科2年生草本植物牛蒡子屬牛蒡（Arctium lappa L.）的干燥成熟果實(shí)，為常用中藥，有疏風(fēng)散熱、解毒透疹、利咽消腫等功效。有研究表明，牛蒡子水提物對(duì)慢性乙醇刺激誘發(fā)的大鼠肝損傷［5］，以及四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）或?qū)σ阴０被釉斐傻男∈蠹毙愿螕p傷［6］均有良好的保護(hù)作用。牛蒡子苷元（arctigenin，ATG）作為牛蒡子中主要成分，是否能逆轉(zhuǎn)繼發(fā)于肝損傷的纖維化進(jìn)程及其相關(guān)機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，采用血小板源性生長(zhǎng)因子BB（platelet-derived growth factor-BB）體外刺激HSC活化，ATG可通過(guò)上調(diào)p27kip1蛋白表達(dá)，使激活的HSC生長(zhǎng)周期阻滯于G0/G1期，從而抑制其惡性增殖的能力［7］。本研究擬在整體動(dòng)物模型上，觀察ATG對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的治療作用，并進(jìn)一步從細(xì)胞周期調(diào)控角度探討ATG影響HSC增殖的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥物、試劑和儀器

CCl4，批號(hào)20120220，成都市科龍化工試劑廠；苯巴比妥，批號(hào)130602，上海信誼藥廠有限公司；ATG，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，純度＞99.5%；秋水仙堿（colchicine，COL），貨號(hào)C3915，美國(guó)Sigma公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transami-nase，GOT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）和羥脯氨酸（hydroxypro-line，HYP）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；RIPA組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（批號(hào)AA132），江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；兔細(xì)胞周期蛋白D1 （cyclin D1）單克隆抗體，批號(hào)YE102505，美國(guó)Epitomics公司；兔細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2 （cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、CDK4和大鼠p27kip1單克隆抗體，批號(hào)分別為D1211，D0711和L2309，美國(guó)Santa Cruz公司；兔增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體，批號(hào)1，美國(guó)CST公司；兔p21cip1多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體，批號(hào)分別為G22121，AB04141和121107，美國(guó)Bioworld公司；FITC-羊抗兔IgG和Cy3-羊抗小鼠IgG抗體，武漢博士德生物工程有限公司。Multiskan GO型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；3K15型4℃低溫離心機(jī)，德國(guó)Sigma-Aldrich公司；041BR88778型蛋白電泳和電轉(zhuǎn)移裝置及ChemiDocTMXRS+型化學(xué)發(fā)光儀，美國(guó)Bio-Rad公司；T10B型電動(dòng)組織勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；EclipseE200型正置熒光顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2動(dòng)物、分組和給藥

72只成年Sprague-Dawley大鼠，♂，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200 g，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（渝）2012-0005。飼養(yǎng)條件為溫度20～24℃，相對(duì)濕度為55%，自由進(jìn)食及飲水。隨機(jī)均分為6組，分別為溶劑對(duì)照組、ATG 3.0 mg·kg-1組、CCl4模型組、CCl4+ATG 1.0和3.0 mg·kg-1組、CCl4+ COL 0.1 mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組。大鼠肝纖維化模型的復(fù)制參照文獻(xiàn)［8］的方法，略有修改。大鼠在造模第1周飲用0.03%苯巴比妥（苯巴比妥30 mg，溶于100 mL水中）以誘導(dǎo)混合功能氧化酶活性，增加CCl4代謝產(chǎn)物的生成，提高造模成功率，并縮短造模周期。除溶劑對(duì)照組和單用ATG 3.0 mg·kg-1組（按體質(zhì)量sc給予等量花生油）外，其他組首次sc給予40%CCl4花生油混合液5 mL·kg-1，以后每次注射2 mL·kg-1，每周2次，連續(xù)注射8周誘導(dǎo)出肝纖維化模型。自造模第5周起，按10 mL·kg-1分別ig給予不同劑量的藥物，每天1次，連續(xù)4周。ATG ig給藥劑量參考文獻(xiàn)［9］，并經(jīng)過(guò)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。溶劑對(duì)照組和模型組ig給予等體積的藥物溶媒（5%DMSO）。

1.3大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定

造模之前稱量大鼠體質(zhì)量，并在之后每周測(cè)一次體質(zhì)量，在第8周，末次給藥1 h后，大鼠在麻醉下股動(dòng)脈放血處死，稱量大鼠體質(zhì)量和肝、脾濕重。肝、脾指數(shù)=肝、脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.4血清肝功能指標(biāo)測(cè)定

股動(dòng)脈取血，血樣不抗凝，取血1 h后以3000×g離心15 min，分離血清，按試劑盒說(shuō)明測(cè)量血清中GPT，GOT，ALB和TBIL肝功能指標(biāo)水平。

1.5肝組織病理檢查

取大鼠肝左外葉，冰生理鹽水沖洗，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色和Masson染色，光鏡下觀察組織形態(tài)變化，參照文獻(xiàn)［10］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。

1.6肝組織中羥脯氨酸含量測(cè)定

精確稱取大鼠肝左外葉組織濕重30～100 mg，置于EP管中，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定大鼠肝組織中HYP含量。

1.7免疫熒光法檢測(cè)活化的肝星狀細(xì)胞增殖

將大鼠肝左外葉冰凍切片用冰丙酮固定，10%山羊血清封閉30 min后，加入含有大鼠α-SMA單抗和兔PCNA單抗的混合液，在4℃下孵育過(guò)夜。充分洗滌后滴加含有FITC-羊抗兔IgG和Cy3-羊抗小鼠IgG的混合液，37℃孵育1 h，洗去二抗，用50%的甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8Western蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)

取大鼠肝左外葉組織，置于EP管中，加入RIPA強(qiáng)裂解液，使用電動(dòng)組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取總蛋白，采用BCA比色法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混勻，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃下與一抗孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，結(jié)果用Quantity One軟件定量分析條帶的積分吸光度值（integrated absorbance，IA），依目標(biāo)蛋白與內(nèi)標(biāo)蛋白IA表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。單因素方差分析比較各組間差異，當(dāng)差異顯著時(shí)（P＜0.05），組間兩兩比較采用Tukey法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等級(jí)資料在比較各組間差異時(shí)，采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，當(dāng)差異顯著時(shí)（P＜0.05），組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)和脾指數(shù)的影響

與溶劑對(duì)照組比較，CCl4模型組大鼠的肝、脾指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。而單用ATG 3.0 mg·kg-1后，與溶劑對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CCl4模型組比較，ATG 1.0和3.0 mg·kg-1可顯著提高CCl4損傷大鼠降低的體質(zhì)量，同時(shí)明顯降低CCl4模型大鼠肝、脾指數(shù)（P＜0.05），COL 0.1 mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝、脾指數(shù)與CCl4模型組比較，也顯著降低（P＜0.05），而其體質(zhì)量與CCl4模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

表2結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，CCl4模型組大鼠血清中GPT，GOT和TBIL水平顯著升高，ALB濃度顯著降低（P＜0.05）。而單用ATG 3.0 mg·kg-1處理后，與溶劑對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CCl4模型組比較，ATG 1.0和3.0 mg·kg-1能顯著降低CCl4模型大鼠血清中GPT，GOT和TBIL水平，升高ALB濃度（P＜0.05），COL 0.1 mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組血清中GOT和TBIL含量也明顯降低（P＜0.05），而血清中GPT水平與CCl4模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1，各組的肝纖維化分級(jí)結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)溶劑對(duì)照組和ATG 3.0 mg·kg-1組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周整齊排列。CCl4模型組肝細(xì)胞脂肪變性、壞死；大量的纖維組織向肝小葉內(nèi)伸展，并與鄰近匯管區(qū)及肝靜脈相連，纖維間隔較厚，分割包繞肝實(shí)質(zhì)，形成大小不一的假小葉。ATG 1.0和3.0 mg·kg-1和COL 0.1 mg·kg-1能明顯減輕CCl4所致的慢性肝纖維化程度，對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維的增生、肝小葉的破壞和假小葉的形成均有明顯的抑制作用。

Tab.1 Effect of arctigenin（ATG）on body mass，livers and spleen indices of CCl4-injured rats

Fig.1 Effect of ATG on hepatic morphology and archi-tecture by HE staining（HE×200）.See Tab.1 for the rat treatment.The arrows indicate the necrotic fibrous septa.

各組Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖2，溶劑對(duì)照組和ATG 3.0 mg·kg-1組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，僅在匯管區(qū)與中央靜脈區(qū)血管壁附著藍(lán)色，無(wú)明顯膠原增生。CCl4模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝組織匯管區(qū)和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，有大量假小葉形成，分割包繞肝實(shí)質(zhì)。ATG 1.0 和3.0 mg·kg-1和COL 0.1 mg·kg-1能不同程度地減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，匯管區(qū)、小葉內(nèi)、小葉間膠原纖維間隔減少、變細(xì)，僅纖維間隔內(nèi)可見(jiàn)脂肪空泡形成，部分較細(xì)的藍(lán)色纖維走行于血管周圍，無(wú)假小葉形成。

Fig.2 Effect of ATG on collagen deposition by Masson staining（Masson×200）.See Tab.1 for the rat treatment. The arrows show the collagen fiber.

2.4牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠肝組織羥脯氨酸含量的影響

表4結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組比較，CCl4模型組大鼠肝組織中HYP含量升高2.6倍（P＜0.05）。ATG 3.0 mg·kg-1組與溶劑對(duì)照組相比較，HYP含量無(wú)顯著差異。與CCl4模型組比較，ATG 1.0和3.0mg·kg-1能顯著降低大鼠肝組織中HYP含量（P＜0.05），COL 0.1 mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝組織中HYP含量也明顯降低（P＜0.05）。

Tab.4 Effect of ATG on hepatic hydroxyproline（HYP）content in CCl4-injured rats

2.5牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞增殖能力的影響

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，CCl4模型組大鼠肝組織內(nèi)激活的HSC大量增殖（表現(xiàn)出疊加為黃色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，如箭頭指示），而CCl4+ATG 1.0 和3.0 mg·kg-1組和COL 0.1 mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組中僅表達(dá)少量熒光標(biāo)記雙陽(yáng)性細(xì)胞。

2.6牛蒡子苷元對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的慢性肝纖維化大鼠細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的影響

如圖4所示，溶劑對(duì)照組和ATG 3 mg·kg-1組僅表達(dá)少量cyclin D1，CCl4模型組有明顯的cyclin D1表達(dá)上調(diào)。經(jīng)過(guò)ATG 1.0和3.0 mg·kg-1及COL處理后，cyclin D1表達(dá)水平明顯低于CCl4模型組（P＜0.05）。同時(shí)，CCl4模型組出現(xiàn)CDK2和CDK4蛋白高表達(dá)，與溶劑對(duì)照組和ATG 3.0 mg·kg-1組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。ATG 1.0和3.0 mg·kg-1及COL 0.1 mg·kg-1處理后，大鼠肝組織中CDK2 和CDK4蛋白表達(dá)水平也顯著降低（P＜0.05）。

溶劑對(duì)照組和ATG 3.0 mg·kg-1組有較高的細(xì)胞周期阻抑物蛋白p21cip1和p27kip1表達(dá)，而經(jīng)過(guò)CCl4處理后，模型組大鼠中僅有微弱的p21cip1和p27kip1表達(dá)。同時(shí)，經(jīng)ATG 1.0和3.0 mg·kg-1及COL 0.1 mg·kg-1處理后，與CCl4模型組比較，p21cip1蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)明顯改變，而p27kip1蛋白表達(dá)水平明顯高于CCl4模型組（P＜0.05）。溶劑對(duì)照組和ATG 3.0 mg·kg-1組中，僅見(jiàn)少量PCNA表達(dá)，而CCl4模型組中有較高PCNA的表達(dá)，經(jīng)過(guò)ATG 1.0和3.0 mg·kg-1及COL 0.1 mg·kg-1處理后，可明顯降低CCl4模型組大鼠肝組織中PCNA的表達(dá)水平（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of ATG on proliferation of HSC in fibrotic rats induced by CCl4（Immunofluorescence×200）.See Tab.1 for the rat treatment.The arrows show the numbers of activated and proliferative HSC〔α-smooth muscle actin（α-SMA）/proliferating cell nuclear antigen（PCNA）dual-positive cells〕in the CCl4model group are notably higher than those found in the vehicle group.

Fig.4 Effect of ATG on expression of cell cycle-related protein by Western blotting.See Tab.1 for the rat treatment.A：immunoblots are shown for each protein.B-D：quantitation of proteins，band intensities were converted to arbitrary densitometric units，normalized by the value of β-actin.Lane 1-2：vehicle；lane 3-4：ATG 3.0 mg·kg-1；lane 5-6：CCl4model；lane 7-8：CCl4+ATG 3.0 mg·kg-1；lane 9-10：CCl4+ATG 1.0 mg·kg-1；lane 11-12：CCl4+Col 0.1 mg·kg-1.CDK：cyclin-dependent kinase.±s，n=8.*P＜0.05，compared with vehicle group；#P＜0.05，compared with CCl4model group.

3　討論

肝纖維化是在各種致病因子的作用下引起的慢性肝損傷，是多種慢性肝疾病的共同病理過(guò)程，如得不到有效控制，它很可能導(dǎo)致肝硬變，甚至肝癌［11］。研究表明，ATG具有較強(qiáng)的抗炎、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等活性［5-6，12］，而ATG的體內(nèi)抗肝纖維化作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，經(jīng)ATG治療后，CCl4誘導(dǎo)的纖維化大鼠中血液生化異常變化及肝病理?yè)p害均獲得顯著改善。同時(shí)，給予ATG治療后，肝內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、肝小葉的破壞和假小葉的形成明顯減輕，提示ATG對(duì)CCl4所致的大鼠肝纖維化有顯著治療作用。

處于靜息狀態(tài)的HSC被激活并大量增殖，被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵步驟，而α-SMA在HSC中的高表達(dá)，被認(rèn)為是HSC激活的標(biāo)志。本研究通過(guò)組織免疫熒光法發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠肝組織內(nèi)，出現(xiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)α-SMA的細(xì)胞，同時(shí)組織中PCNA呈陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)也大量增加，提示此時(shí)大鼠肝中的HSC處于激活后的增殖狀態(tài)。經(jīng)ATG處理后，大鼠肝組織中α-SMA和PCNA雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，提示ATG可能通過(guò)抑制HSC激活及其隨后的增殖狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程。

細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期的運(yùn)行實(shí)現(xiàn)的，在真核細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控中，G0/G1-S期之間的限制點(diǎn)（restriction point，又稱R點(diǎn)）是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)經(jīng)傳遞、整合，匯集到細(xì)胞核對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)。處于G1期的HSC在生長(zhǎng)因子的刺激下表達(dá)cyclin D1，進(jìn)而cyclin D1與CDK4/6結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行磷酸化［13］。磷酸化的cyclin D1與CDK4/6復(fù)合物可進(jìn)一步促使“成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤”（retinoblastoma，RB）蛋白磷酸化，而相繼周期蛋白E-CDK2組成的復(fù)合物進(jìn)一步磷酸化RB蛋白。RB的高度磷酸化解除了其對(duì)E2F等基因轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，從而啟動(dòng)S期相關(guān)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞通過(guò)G1期進(jìn)入S期［14］。由上可知，cyclin D1/CDK復(fù)合物對(duì)于細(xì)胞G0/G1-S期轉(zhuǎn)變起到至關(guān)重要的作用。p27kip1作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，通過(guò)抑制CDK的激活過(guò)程，或抑制已激活的cyclin D1/CDK激酶活性，阻止RB蛋白磷酸化，使細(xì)胞無(wú)法通過(guò)G0/G1-S期限制點(diǎn)，從而抑制細(xì)胞的增殖［15］。本研究結(jié)果顯示，在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝組織內(nèi)存在有較高水平的cyclin D1，CDK2，CDK4和PCNA蛋白表達(dá)，同時(shí)p27kip1蛋白水平相對(duì)較低。因此，被激活的HSC處于DNA合成相對(duì)活躍的S期。經(jīng)過(guò)ATG治療后，大鼠肝組織cyclin D1，CDK2，CDK4和PCNA蛋白表達(dá)水平明顯降低，p27kip1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，使HSC停滯于G0/G1期，從而恢復(fù)其相對(duì)靜息的低增殖狀態(tài)，這可能是ATG抑制HSC增殖的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了ATG對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷有保護(hù)作用，同時(shí)，ATG通過(guò)抑制cyclin D1與CDK2和CDK4，上調(diào)細(xì)胞周期阻抑物蛋白p27kip1的表達(dá)水平，使得HSC無(wú)法進(jìn)入自主分裂程序，從而抑制活化的HSC增殖，這可能是ATG抗肝纖維化的作用機(jī)制。

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（本文編輯：賀云霞）

Therapeutic effect of arctigenin on carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats

ZHANG Xiao-xun，WANG Jun，ZHAO Yu，ZHANG Jing-yao，LI Ao
（College of Pharmacy and Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China）

Abstract：OBJECTlVETo investigate the effect of arctigenin（ATG）on liver fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride（CCl4）and to explore its underlying mechanism.METHODS Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups：vehicle，ATG 3.0 mg·kg-1group，CCl4model group，CCl4+ATG 1.0 and 3.0 mg·kg-1groups，and CCl4+colchicine（COL）0.1 mg·kg-1（toxicity）group. Liver fibrosis was induced by subcutaneous injection of CCl4in rats for 8 weeks.ATG and colchicine were administrated ig once a day starting from the fifth week after the CCl4treatment for 4 weeks subsequent.At the end of the study，glutamic pyruvic transaminase（GPT），glutamic oxaloacetic transaminase（GOT），albumin（ALB），and total bilirubin（TBIL）as well as the contents of hydroxyproline （HYP）in liver tissues were measured.Histopathological changes were observed in the liver tissues using hematoxyline-eosin（HE）and Masson’s trichrome staining.The proliferation of hepatic stellate cells（HSC）and expression of cell cycle-related proteins were assayed by indirect immunofluores-cence staining and Western blotting，respectively.RESULTS Compared with CCl4model group，ATG 1.0 and 3.0 mg·kg-1improved the liver function by decreasing serum contents of GPT，GOT and TBIL （P＜0.05），and increasing serum content of albumin（P＜0.05）.Histological results indicated that ATG 1.0 and 3.0 mg·kg-1alleviated liver damage and reduced the formation of fibrous septa.Moreover，ATG 1.0 and 3.0 mg·kg-1significantly decreased liver HYP when compared with CCl4model group（P＜0.05）.In addition，CCl4-induced proliferation of activated HSC was inhibited by ATG 1.0 and 3.0 mg·kg-1，and this was accompanied by down-regulation of cyclin D1，cyclin-dependent kinase（CDK）2，CDK4，and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）（P＜0.05），and up-regulation of p27kip1in activated HSC （P＜0.05）.CONCLUSlON ATG can alleviate hepatic injury and fibrosis induced by CCl4，which is probably associated with suppression of the proliferation of activated HSC.

Key words：arctigenin；hepatic fibrosis；hepatic stellate cells；cell cycle

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-3002（2016）01-0053-08

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81001675）；and Chongqing Natural Science Foundation（cstc2014jcyjA10030） LI Ao，E-mail：ao_livip@sina.com，Tel：（023）62400251，F(xiàn)ax：（023）68906603

收稿日期：（2015-09-21接受日期：2015-12-20）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81001675）；重慶市科委前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究（一般）項(xiàng)目（cstc2014jcyjA10030）

作者簡(jiǎn)介：張曉珣，男，碩士研究生，主要從事慢性纖維化疾病的中醫(yī)藥防治研究。

通訊作者：李 傲，E-mail：ao_livip@sina.com，Tel：（023）62400251，F(xiàn)ax：（023）68906603