吳　迪　徐敬東　朱進霞

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

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大黃提取液促進大鼠結(jié)腸肥大細胞和嗜酸性粒細胞增多反應(yīng)

吳迪徐敬東*朱進霞*

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

【摘要】目的 大黃具有清熱解毒和潤腸通便的作用。本實驗結(jié)果顯示短期服用大黃后，肥大細胞和嗜酸性粒細胞在大鼠的結(jié)腸有大量聚集。本研究意在探討大黃提取液促進大鼠結(jié)腸肥大細胞和嗜酸性粒細胞增多反應(yīng)的作用。方法使用免疫組織化學(xué)、免疫熒光及酶聯(lián)免疫吸附的方法探討不同劑量大黃灌胃后，大鼠結(jié)腸部位肥大細胞、嗜酸性粒細胞和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)及白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的變化。結(jié)果大黃可激活肥大細胞、并可使嗜酸性粒細胞出現(xiàn)明顯聚集，同時引起IFN-γ增加和IL-10降低的免疫保護機制。結(jié)論短期服用大黃可以引起結(jié)腸部位肥大細胞和嗜酸性粒細胞聚集，該作用對大黃的潤腸通便作用具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】大黃；肥大細胞；嗜酸性粒細胞；過敏反應(yīng)

大黃為蓼科大黃屬植物，大黃的干燥根和塊莖作為傳統(tǒng)中藥大黃(RheumpalmatumL.)被廣泛使用。藥典中所使用的藥品大黃為藥用大黃(RheumoffcinaleBaill.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.exBalf.)和掌葉大黃(RheumpalmatumL.)。大黃的主要成分為蒽醌類化合物，有研究顯示，大黃具有抗病毒[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗糖尿病[4]、消炎[5]等作用。大黃主要發(fā)揮作用的成分——大黃素能減少炎性反應(yīng)細胞因子和炎性介質(zhì)的釋放，發(fā)揮抗炎作用[6]。肥大細胞激活后可釋放多種細胞因子并趨化嗜酸性粒細胞聚集[7]。短期使用大黃，會引起明顯的腹瀉，但是腹瀉作用又可以呈現(xiàn)一種負反饋的調(diào)節(jié)特性，該作用的可能機制未見報道。本文探討短期使用大黃所引起腹瀉以及負反饋的可能機制。

1材料與方法

1.1材料

唐古特大黃干燥根及塊莖飲片采購于北京同仁堂，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院王文教授進行物種鑒定。肥大細胞類糜蛋白酶抗體(美國Abcam公司，貨號：Ab2377);大鼠酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司);萊卡冰凍切片機(德國Leica，型號：CM1850);萊卡共聚焦顯微鏡(德國Leica，型號：TCSSP5);萊卡生物顯微鏡(德國Leica，型號：DM5000)。

1.2實驗方法

1.2.1大黃提取液的制備

將大黃干燥根及塊莖飲片于蒸餾水中浸泡30 min后，中高火煮沸2 h，定容至1 mg/mL，保存至4 ℃冰箱。

1.2.2實驗動物的給藥方法

雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量220～250 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，經(jīng)實驗動物福利委員會許可，實驗動物許可證號:SCXK(京)2012-0001，動物在室溫條件飼養(yǎng)，正常更替光照，24 h 食水供應(yīng)。采用數(shù)字表法將其隨機分為實驗組和對照組， A 組：正常對照組；B 組:實驗3 g/kg劑量組；C 組:實驗6 g/kg劑量組。實驗組根據(jù)劑量安排給大鼠服用大黃提取液。正常對照組給予6 g/kg的蒸餾水。

1.2.3取材

以4 mL/kg的劑量給予大鼠10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛麻醉，開腹腔后從腹主動脈取血，靜置12 h，離心8 000 r/min，取上層清液即血漿，使用ELISA法測定結(jié)果。取大鼠結(jié)腸于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中固定24 h，依次用含有15%(質(zhì)量分數(shù))、30%(質(zhì)量分數(shù))蔗糖的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)脫水24 h。使用OCT包埋劑包埋后，進行7 μm的連續(xù)切片。

1.2.4免疫熒光

大鼠結(jié)腸切片在室溫中風(fēng)干24 h后，浸泡在檸檬酸鈉中，用微波爐加熱保持在95 ℃～100 ℃，進行抗原修復(fù)15 min，使用PBS連續(xù)洗滌3次，每次5 min，使用PBST(PBS +2‰Tween-20)配制而成的5%(體積分數(shù))驢血清進行封閉30 min，孵育一抗過夜，再使用PBST洗滌后孵育二抗2 h，使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)進行細胞核的染色，使用甘油封片。

使用共聚焦顯微鏡在放大20倍的物鏡下在每張切片上拍攝8張照片，使用Image-Pro Plus 6.0圖像統(tǒng)計軟件統(tǒng)計特定陽性熒光相對表達量，取8張照片的熒光相對表達量的平均值。

1.2.5HE染色

嗜酸性粒細胞可在HE染色后顯示為紅色。對每只大鼠結(jié)腸隨機切取3張切片，使用顯微鏡在放大40倍的物鏡下在每張切片隨機觀察10個視野內(nèi)嗜酸性粒細胞的數(shù)量，取30張計數(shù)值的平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件處理。所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標準誤(mean±SE)表示。各指標比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的Turkey方法，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大黃促進大鼠腹瀉的作用

與正常組大鼠相比，用3 g/kg、6 g/kg大黃灌胃后，大鼠糞便內(nèi)水的量隨大黃增加而增加，服用大黃后，糞便更易排出，結(jié)果詳見圖1。

2.2大黃對大鼠結(jié)腸肥大細胞的影響

在給大鼠灌胃不同劑量大黃12 h后，取遠端結(jié)腸，使用肥大細胞標記物類糜蛋白酶用免疫熒光定位技術(shù)，觀察到有肥大細胞聚集現(xiàn)象。正常大鼠結(jié)腸部位肥大細胞每個視野熒光相對表達量為(22.33±8.02)，3 g/kg劑量組為(35.40±5.84)增加近58.53%(P<0.05,n=8)，6 g/kg劑量組則為(139.70±34.38)，大鼠肥大細胞增加近426.3%(P<0.01,n=8)，結(jié)果詳見圖2。結(jié)果提示大黃具有刺激結(jié)腸黏膜下肥大細胞增多和聚集的效應(yīng)。

圖1　腸道內(nèi)糞便形狀的對比

圖2　肥大細胞在結(jié)腸部位的分布

2.3大黃對大鼠結(jié)腸嗜酸性粒細胞數(shù)量的影響

使用HE染色對比正常大鼠結(jié)腸部位的嗜酸性粒細胞數(shù)量，在3 g/kg組出現(xiàn)嗜酸性粒細胞顯著聚集現(xiàn)象，平均每個視野下從正常組(3.12±2.48)個增長至(9.32±3.63)個(P<0.01,n=8)，而6 g/kg組較3 g/kg組，嗜酸性粒細胞聚集現(xiàn)象更加明顯，達到平均每個視野(14.06±2.21)個(P<0.001,n=8)，結(jié)果詳見圖3。

圖3　大鼠結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細胞分布

A:control group; B: Rhubarb group at the concentration of 3 g/kg; C: Rhubarb group at the concentration of 6 g/kg; D: bar as a statistical results; Scale bar：40 μm;***P<0.001vscontrol group;n=8.

2.4大黃對IFN-γ 及IL-10的影響

使用ELISA法測定血清中干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)及白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的變化，如圖4A結(jié)果顯示，正常組大鼠血液中IFN-γ為(183.82±13.40)ng/L，3 g/kg組為(193.63±4.11)ng/L，增加約5.44%(P>0.05，n=8)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；6 g/kg組為(226.04±16.80)ng/L，與正常組相比，IFN-γ明顯增加約22.96%(P<0.05，n=8)。結(jié)果詳見圖4B，3 g/kg和6 g/kg大黃組大鼠血液中的IL-10均有顯著下降，分別為(112.52±6.40)pg/mL和(109.91±4.188)pg/mL，與正常組大鼠血液中濃度(136.60±10.88)pg/mL相比，分別下降17.62%(P<0.05，n=8)和19.53%(P<0.01，n=8)。結(jié)果提示短期使用大黃提取液后具有升高IFN-γ而降低IL-10的作用。

圖4　大鼠血液中IFN-γ及IL-10的測定

A: content of IFN-γ in blood of rat in the different groups; B: content of IL-10 in blood of rat in the different groups;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group; IFN-γ:interferon-γ; IL-10: interleukin-10；n=8.

3討論

當嗜堿性粒細胞從血管游離至結(jié)締組織和黏膜上皮內(nèi)時，稱為肥大細胞，其結(jié)構(gòu)和功能與嗜堿性粒細胞十分相似，和嗜酸性粒細胞在過敏反應(yīng)中共同發(fā)揮主要作用[7]。在過敏反應(yīng)中，肥大細胞會迅速聚集并脫顆粒，釋放組胺、白三烯、趨化因子和多種炎性反應(yīng)因子，引發(fā)機體消化道、呼吸道、皮膚等部位局部的超敏反應(yīng)，嚴重的會引起全身性的過敏反應(yīng)[8]。肥大細胞被激活時，釋放出趨化因子，使嗜酸性粒細胞聚集到同一局部[8-9]，并限制肥大細胞或嗜堿性粒細胞的活性。嗜酸性粒細胞作為白細胞的一種，在炎性反應(yīng)、過敏反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、免疫防御中發(fā)揮作用[10]。嗜酸性粒細胞可產(chǎn)生前列腺素E使嗜堿性粒細胞合成釋放生物活性物質(zhì)的過程受到抑制；同時可以吞噬嗜堿性粒細胞所排出的顆粒，使其中含有生物活性物質(zhì)不能發(fā)揮作用；另外可以釋放組胺酶等酶類，抑制肥大細胞所釋放的組胺等活性物質(zhì)，對由肥大細胞引起的反應(yīng)起到一定的抑制作用作用[11]。

本實驗中用中藥大黃提取液灌胃大鼠12 h后，出現(xiàn)大鼠糞便中水的量增加，排便數(shù)量增加的現(xiàn)象，且在結(jié)腸黏膜下層出現(xiàn)肥大細胞和嗜酸性粒細胞明顯增加的現(xiàn)象，提示在藥物使用初期可能激活了機體的免疫保護機制，使得藥物引起的腹瀉得到抑制或緩解。

肥大細胞還可以通過產(chǎn)生IL-10介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，它可以抑制 TH1 細胞合成IL-2、IFN-γ[12]；并通過下調(diào)單核細胞表面主要組織相容性抗原Ⅱ(classⅡmajor histocompatibility complex, MHCⅡ)的表達,降低其抗原呈遞的作用；降低T淋巴細胞活性，抑制炎性細胞的激活、遷移與黏附和炎性反應(yīng)因子的合成與釋放，而且IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-n,TNF-α)、巨噬細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)的合成都受到內(nèi)源性與外源性IL-10在轉(zhuǎn)錄水平的負調(diào)節(jié)，抑制炎性反應(yīng)發(fā)生，達到抗炎的效果[13]。而在本實驗中筆者觀察到，對正常大鼠使用大黃后，IL-10沒有升高，反而出現(xiàn)下降趨勢，這說明短期使用大黃引起的肥大細胞聚集引起炎性反應(yīng)的同時抑制炎性反應(yīng)的過程，這提示可能啟動了自身的免疫保護作用。

大黃能減少炎性反應(yīng)細胞因子和炎性反應(yīng)介質(zhì)的釋放, 起到抗炎作用作用[14]。但對正常大鼠短期使用大黃會出現(xiàn)炎性反應(yīng)現(xiàn)象，并且出現(xiàn)腹瀉及結(jié)腸輕微水腫和充血現(xiàn)象，這與腸道過敏反應(yīng)表現(xiàn)相一致，提示在使用大黃提取液的早期肥大細胞使局部組織胺增加，引起了腸道的局部免疫反應(yīng)，引起腸道的運動和分泌功能的增強；同時嗜酸性粒細胞的增多又抑制了肥大細胞引起了腸道的局部免疫反應(yīng)。該研究結(jié)果可以解釋大黃既可以引起的腹瀉，同時又可以對腹瀉起到負反饋調(diào)節(jié)作用。

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編輯孫超淵

Rhubarb extract solution enhances mast cells and eosinophils in rat colon

Wu Di, Xu Jingdong*, Zhu Jinxia*

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

【Abstract】ObjectiveSince its effect of detoxification and laxative, it was found that mast cells and eosinophils have a large concentration on the rat colon after a short-term administration of Rhubarb in our investigation. This phenomenon of allergy caused by Rhubarb has not been reported. The aim of the study is to investigate the function that Rhubarb extract solution should be able to aggrandize mast cells and eosinophils on rat colon. MethodsIn order to explore the changes of mast cells, eosinophils, interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-10 (IL-10) on the effect of different doses of Rhubarb, we gave the rats Rhubarb extract solution by intragastric administration. The samples were measured by means of immunohistochemistry, immunofluorescence and ELISA. ResultsRhubarb could make mast cells activated and eosinophils accumulated significantly, causing an increase of IFN-γ and a decrease of IL-10, as while other phenomenon of allergy.ConclusionAdministration of Rhubarb for 12 h can cause mast cell and eosinophil enhanced and accumulated in rat colon. It is vague how and why Rhubarb enhances the mast cell and eosinophil, which needs further research.

【Key words】Rhubarb；mast cell；eosinophil；allergy

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81274173),北京市自然科學(xué)基金(7122017)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81274173)， Natural Science Foundation of Beijing (7122017).

*Corresponding authors， E-mail：xujingdong@163.com； zhu_jx@ccmu.edu.cn

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.019]

【中圖分類號】R 285

(收稿日期：2016-03-01)

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-06-0719∶00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1900.028.html

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