胡立新　宋文琪　蘇建榮　董　方　王　艷

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京 100045)

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兒童感染沙門(mén)菌耐藥特點(diǎn)及鑒定方法的研究

胡立新宋文琪*蘇建榮董方王艷

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京 100045)

【摘要】目的 研究引起兒童感染的沙門(mén)菌耐藥特點(diǎn)及快速鑒定方法。方法選擇沙門(mén)菌75株，使用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)和血清學(xué)試驗(yàn)對(duì)所有菌株進(jìn)行鑒定；使用16S rRNA基因測(cè)序法鑒定；使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)法鑒定，以上兩種方法結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。使用Kerby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)常用抗生素進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，使用聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR)測(cè)定對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的基因。結(jié)果75株沙門(mén)菌中，鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌檢出率最高，分別為32株和26株。16S rRNA基因測(cè)序法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的符合率為100%。MALDI-TOF-MS法的屬符合率為100%，其中鑒定率在99.9%以上的為17株，90%以上的為32株，80%以上的為26株，結(jié)果均可信，但其對(duì)具體血清型的符合率不高。75株沙門(mén)菌中，耐藥率最高的是氨芐西林(69.3%，52/75)，其次是氨芐西林/舒巴坦(44.0%，33/75)，第三是萘啶酸(42.7%，32/75)。75株沙門(mén)菌中共檢出19株對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，占25.3%。19株中有15株攜帶blaCTX-M基因(8株為blaCTX-M-14，2株為blaCTX-M-9，1株為blaCTX-M-34，2株為blaCTX-M-3，2株為blaCTX-M-15)，8株攜帶blaTEM-1基因，4株攜帶blaOXA-1基因。結(jié)論16S rRNA基因測(cè)序法作為細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，以其快速準(zhǔn)確著稱，可作為傳統(tǒng)鑒定法的補(bǔ)充方法。MALDI-TOF-MS法可以快速鑒定沙門(mén)菌，但僅在科研模式下指向性地提示血清型，因此需采用其他輔助技術(shù)進(jìn)行鑒定。引起兒童腹瀉的沙門(mén)菌對(duì)多種抗生素耐藥，對(duì)3代頭孢菌素類的耐藥主要由blaCTX-M型引起。

【關(guān)鍵詞】沙門(mén)菌；16S rRNA基因測(cè)序；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；耐藥；blaCTX-M

沙門(mén)菌病是全球性(尤其是發(fā)展中國(guó)家)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。沙門(mén)菌廣泛存在，主要污染動(dòng)物性食品，尤其是禽肉和蛋類，因此極易引起人類感染。沙門(mén)菌中毒的癥狀主要以急性胃腸炎為主，一般預(yù)后良好，但是老人、兒童和體弱者如不及時(shí)處理感染者可死亡，是危害全球兒童健康的重要因素之一[1-3]。在臨床工作中，對(duì)標(biāo)本中分離得到的沙門(mén)菌進(jìn)行鑒定并分型是診斷過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題。而當(dāng)前沙門(mén)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)和分型一般存在敏感性低、耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的沙門(mén)菌鑒定和分型對(duì)輔助臨床診斷和治療是十分必要的。

1材料與方法

1.1菌株與試劑

收集2012年3月至2014年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院分離的沙門(mén)菌，剔除以同一患者分離的重復(fù)菌株，共計(jì)75株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218、大腸埃希菌ATCC8739。MALDI-TOF-MS儀：法國(guó)生物梅里埃公司。沙門(mén)氏菌診斷血清(60瓶)：泰國(guó)S&A公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：北京天根公司。PCR擴(kuò)增試劑盒：上海生工公司。引物：北京天一輝遠(yuǎn)公司。

1.2細(xì)菌傳統(tǒng)法鑒定

用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和生物化學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定沙門(mén)菌，采用血清凝集法對(duì)血清型做進(jìn)一步鑒定。

1.316S rRNA基因序列分析法鑒定沙門(mén)菌

采用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，引物序列參照文獻(xiàn)[1]，采用細(xì)菌通用引物，目的片段長(zhǎng)度約為1 500 bp，由北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行合成，其序列如下：27F:(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′);1492R:(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′);后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL，具體成分見(jiàn)表1。

在5 μL PCR終產(chǎn)物中加入1 μL的6×Loading Buffer，混勻后加入到1.2%瓊脂糖凝膠的上樣孔中，同時(shí)在第一個(gè)上樣孔中加入6 μL的相對(duì)分子質(zhì)量為 2 000 DNA Marker。在0.5×TBE電泳緩沖液中，以120 V電壓，75 mA電流電泳40 min。在紫外光凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果顯示在1 500 bp處出現(xiàn)單一條帶為陽(yáng)性產(chǎn)物。PCR終產(chǎn)物測(cè)序工作由北京天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司完成。測(cè)序結(jié)果提交到http://blast.ncbi.nlm.nih.gov中進(jìn)行Blast序列比對(duì)進(jìn)行分析，找出最相似的已知序列。

表1　PCR反應(yīng)體系

The reaction conditions are as follows:94 ℃ predegeneration 5 min; 94 ℃ degeneration 1 min, annealed at 55 ℃ 1 min,72 ℃ extension 1.5 min, 40 cycles; 72 ℃ and then extended 5 min.

1.4MALDI-TOF-MS質(zhì)譜法鑒定沙門(mén)菌

從培養(yǎng)基上選取純培養(yǎng)18～24 h的單個(gè)沙門(mén)菌菌落。依次進(jìn)行涂菌，加基質(zhì)，進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過(guò)SARAMIS Premium軟件與儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比較。用相匹配的百分率來(lái)量化結(jié)果，并給出最終的鑒定結(jié)果。

1.5沙門(mén)菌的藥敏試驗(yàn)及耐藥基因的檢測(cè)

選用11種抗生素紙片對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)，具體的名稱及劑量見(jiàn)表2；按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI)[2]2014手冊(cè)的說(shuō)明，對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥的菌株進(jìn)行表型初篩和確證試驗(yàn)；進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢測(cè)，引物序列參照文獻(xiàn)[4]，包括blaTEM，blaSHV，blaOXA，blaCTX-M(表3)。所有引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行合成。

2結(jié)果

2.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

對(duì)75株沙門(mén)菌鑒定表明：分屬于9種血清型，其中鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌檢出率最高，分別檢出32株和26株，其他血清型的沙門(mén)菌檢出率處于較低的水平。各血清型檢出率及構(gòu)成比見(jiàn)表4。好發(fā)季節(jié)以5～9月為最多，其余各月發(fā)病數(shù)量比較零散。

2.216S rRNA基因序列分析法

用上述方法提取細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，均將在1 500 bp處獲得陽(yáng)性條帶，與預(yù)期片段相吻合，如圖1所示。

表2　抗生素紙片的名稱及劑量

表3　PCR引物序列

表4　兒童大便分離出的沙門(mén)菌血清型檢出數(shù)及構(gòu)成比

16S rRNA基因測(cè)序提交到http://blast.ncbi.nlm.nih.gov中進(jìn)行Blast序列比對(duì)進(jìn)行分析，比對(duì)結(jié)果顯示與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鑒定方法的結(jié)果完全一致，可鑒定到具體的血清型，符合率為100%。16S rRNA基因測(cè)序鑒定細(xì)菌準(zhǔn)確，可用于細(xì)菌的分類鑒定。

2.3MALDI-TOF-MS法分析

臨床模式下鑒定結(jié)果均為沙門(mén)菌屬，菌屬鑒定正確率為100%。其中6株鑒定為沙門(mén)菌屬，其余69株鑒定為腸道沙門(mén)氏菌亞種。MALDI-TOF-MS相匹配的百分率，匹配度在99.9%以上的為17株，顯示為墨綠色；90%以上的為32株，顯示為綠色；80%以上的為26株，顯示為黃色，結(jié)果均可信，在科研模式下與儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，質(zhì)譜法能指向性地提示血清型，有利于臨床上的快速鑒定。

2.4沙門(mén)菌的耐藥性分析

所有的菌株對(duì)亞胺培南和美羅培南均敏感。75株沙門(mén)菌株中，21株對(duì)所有的抗生素均敏感，15株對(duì)1種抗生素耐藥，5株對(duì)2種抗生素耐藥，34株對(duì)3種及以上的抗生素耐藥。其中耐藥率最高的是氨芐西林(69.3%，52/75)，其次是氨芐西林/舒巴坦(44.0%，33/75)，萘啶酸(42.7%，32/75)，詳見(jiàn)表5。75株沙門(mén)菌中共檢出19株對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥，占25.3%。

圖1　PCR擴(kuò)增電泳圖

NameofantibioticsResistanceNumberRatio/%IntermediaryNumberRatio/%SensitiveNumberRatio/%Ampicillin5269.3002330.7Chloramphenicol1216.022.76181.3Ciprofloxacin68.0912.06080.0Ceftriaxone1925.311.35573.3Cefepime1520.0006080.0Imipenem000075100.0Meropenem000075100.0Sulfamethoxazole1418.7006181.3Ceftazidime2026.711.35472.0Ampilillin-sulbactam3344.034.03952.0Nalidixicacid3242.722.74154.7

75株沙門(mén)菌中共檢出對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥的菌株19株，占25.3%。19株沙門(mén)菌中有2株未擴(kuò)增出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，其中攜帶blaTEM基因的有8株，經(jīng)DNA測(cè)序表明均為blaTEM-1型；攜帶blaOXA基因的有4株，經(jīng)DNA測(cè)序表明均為blaOXA-1型；攜帶blaCTX-M基因的有15株，包括blaCTX-M-1型5株，blaCTX-M-9型10株。經(jīng)DNA測(cè)序表明，5株blaCTX-M-1型中，1株為blaCTX-M-1亞型，2株為blaCTX-M-3亞型，2株為blaCTX-M-15亞型。10株blaCTX-M-9型中，2株為blaCTX-M-9亞型，8株為blaCTX-M-14亞型。未檢出blaSHV基因、blaCTX-M-2基因和blaCTX-M-8基因。具體的基因型及分布見(jiàn)表6。

表6　19株對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥沙門(mén)菌的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因型別及分布

3討論

從75名患病兒童統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，2歲以下患兒為主要發(fā)病人群，其中男孩居多。從沙門(mén)菌血清學(xué)分型結(jié)果來(lái)看，以B群和D群沙門(mén)菌為優(yōu)勢(shì)菌。鼠傷寒沙門(mén)菌與腸炎沙門(mén)菌為主要的致病菌。這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道[4]的非傷寒沙門(mén)菌血清型以腸炎型及鼠傷寒為主是基本一致的。但是其他血清型，如湯卜遜、豬霍亂、斯坦利、鴨沙門(mén)菌等也有所分離，說(shuō)明沙門(mén)菌的血清型趨于多樣化。這可能與兒童腸道免疫功能尚未發(fā)育成熟、抵抗力低有關(guān)系。

傳統(tǒng)沙門(mén)菌鑒定到血清型需要大量的血清凝集工作。但有時(shí)血清效價(jià)低，血清凝集反應(yīng)弱甚至為陰性，這些都加大了沙門(mén)菌鑒定的難度，因而需要其他方法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確快速鑒定。16S rRNA基因是編碼細(xì)菌染色體上rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，它存在于所有的原核生物中，片段大小約為1 500 bp。存在著保守區(qū)和可變區(qū)的基因，兩者之間的序列編碼成為互相交替排列。因此，16S rRNA可以作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子[5]。本實(shí)驗(yàn)中其對(duì)沙門(mén)菌的鑒定率要優(yōu)于MALDI-TOF-MS法，因其準(zhǔn)確性高，成為傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法中不可或缺的輔助手段。

MALDI-TOF-MS是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種全新的微生物鑒定和分型的技術(shù)，己廣泛地用于微生物的檢測(cè)與鑒定。它對(duì)樣本的要求比較低，且能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)菌株進(jìn)行高通量檢測(cè)，因而越來(lái)越受到人們的關(guān)注[6]。但是在國(guó)內(nèi)外用該方法對(duì)沙門(mén)菌的研究還不多。其不足是與傳統(tǒng)培養(yǎng)血清型的符合率不高，原因可能是MALDI-TOF-MS分析的是細(xì)胞膜上易于通過(guò)激光解吸的蛋白質(zhì)如細(xì)胞受體、黏附素等。而血清學(xué)分型中檢測(cè)的細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)未必是在MALDI-TOF-MS分析中被解吸的蛋白質(zhì)，這兩種檢測(cè)分型方法在原理上不是直接對(duì)應(yīng)的關(guān)系[7]。因此需采用其他的輔助技術(shù)進(jìn)行鑒定，在本研究中采用血清學(xué)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。在實(shí)際檢測(cè)中，如果儀器自帶數(shù)據(jù)庫(kù)信息不足，就需要研究人員豐富數(shù)據(jù)庫(kù)，提高鑒定準(zhǔn)確率。胡驍?shù)萚8]用Bruker質(zhì)譜法建立沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)。沙門(mén)菌的MALDI-TOF-MS法還處于初期階段，受細(xì)菌庫(kù)的限制，鑒定也僅限于方法學(xué)之間的比較。

由于氟喹諾酮類和第三代頭孢菌素具有廣譜、高效的特點(diǎn)，是治療沙門(mén)菌感染的主要藥物。但隨著耐藥菌株的播散和抗生素的濫用，使沙門(mén)菌的治療面臨越來(lái)越大的困難。本研究結(jié)果表明，75株沙門(mén)菌中共檢出對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥的菌株19株，占25.3%，與陳強(qiáng)等[9]關(guān)于兒童感染沙門(mén)菌報(bào)道符合。本研究中頭孢類耐藥率較高，分析其原因可能為：(1)喹諾酮類藥物和氨基糖苷類藥物在兒童應(yīng)用中存在爭(zhēng)議,導(dǎo)致兒科臨床應(yīng)用的抗生素以β-內(nèi)酰胺類為主，其中三代頭孢菌素更是廣泛使用。(2)北京兒童醫(yī)院為三級(jí)甲等兒童專科醫(yī)院，與患者病情較重，三代頭孢菌素使用率高，住院時(shí)間長(zhǎng)，因而導(dǎo)致產(chǎn)酶株的院內(nèi)播散概率大。因此，關(guān)注沙門(mén)菌的流行和耐藥情況，研究其相關(guān)耐藥基因，對(duì)了解菌株的分布，指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素十分必要。

對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥的基因可分為以下幾類：TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型和其他型(如CMY型、VIM型、PER型等)。本研究中19株對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥沙門(mén)菌中共檢出15株攜帶blaCTX-M基因，其中8株為CTX-M-14亞型，這一基因在我國(guó)對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌中最常見(jiàn)[10-14]。同時(shí)檢出了較少見(jiàn)的CTX-M-3，CTX-M-15型，顯示了CTX-M型在本地區(qū)的主導(dǎo)地位。TEM基因型是對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因中常見(jiàn)的基因型，可水解青霉素類、頭孢菌素類抗生素，至今已有178種，并呈全球性分布。本試驗(yàn)中有8株攜帶TEM型基因，并且伴有CTX-M型和OXA型基因，說(shuō)明細(xì)菌耐藥基因的多樣性和復(fù)雜性。

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編輯慕萌

Research on children infected withSalmonellaidentification methodology and antimicrobial resistance characteristics

Hu Lixin, Song Wenqi*, Su Jianrong, Dong Fang, Wang Yan

(ClinicalLaboratory,BeijingChildren’sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the rapid identification and the antimicrobial resistance characteristics of Salmonella recovered from children. MethodsSelected 75 strains Salmonella which were isolated from children. Via standard biochemical and serological tests for all strains were identified. 16S rRNA sequencing method was used to identify. Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method was used to identify. The results of the above two methods with traditional culture methods were compared and analyzed. Kerby-Bauer disk diffusion method for commonly used antibiotic sensitivity test was used. Polymerase chain reaction (PCR) method was used to analyze extended-sptectrum beta-lactam resistant gene. ResultsSeventy-five Salmonella, Salmonella Typhimurium and Salmonella enteritidis were the predominant serotypes, respectively 32 and 26. The results of 16S rRNA gene sequencing analysis compared with the traditional culture method revealed the coincidence rate was 100%. Via the MALDI-TOF-MS method, the genus coincidence rate was 100%. The identification rate above 99.9% was 17, above 90% was 32, above 80% was 26. All the results were credible. But its coincidence rate of serotypes is not high. 75 Salmonella, the highest rate of drug resistance was Ampicillin (69.3%, 52/75), followed by ampicillin/sulbactam (44%, 33/75) and nalidixic acid (42.7%, 32/75). 75 Salmonella were detected 19 strains of extended-sptectrum beta-lactam antimicrobial resistance, accounting for 25.3%. Among 19 strains had 15 carrying blaCTX-M gene (8 were blaCTX-M-14, 2 were blaCTX-M-9, 1 was blaCTX-M-34, 2 were blaCTX-M-3, 2 were blaCTX-M-15), 8 strains carried blaTEM-1 gene, 4 strains carried blaOXA-1 gene.Conclusion16S rRNA gene sequencing method is as the gold standard for identification of bacteria, known for its fast and accurate, a supplement traditional methods of identification method. MALDI-TOF-MS method can quickly identify Salmonella, but only directional prompts serotypes in the research mode, and therefore it needs to be identified by other assistive technologies. Salmonella causes diarrhea in children resistant to multiple antibiotics, third generation cephalosporins resistance is mainly caused by CTX-M type.

【Key words】Salmonella; 16S rRNA gene sequencing analysis; matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry; antimicrobial resistant; blaCTX-M

Corresponding author， E-mail：songwenqi1218@163.com

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.023]

【中圖分類號(hào)】R 446.1

(收稿日期：2015-12-08)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-0718∶39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1839.020.html

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