平　浩　牛亦農(nóng)　楊飛亞　王明帥　邢念增

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院泌尿外科，北京 100020)

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CXCR4及NDRG1蛋白在前列腺癌中的表達(dá)及其與侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

平浩*牛亦農(nóng)楊飛亞王明帥邢念增

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院泌尿外科，北京 100020)

【摘要】目的 探討趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CXCR4)及N-myc下游調(diào)節(jié)基因1(N-myc downstream regulated gene 1， NDRG1)在前列腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，明確其與前列腺癌惡性程度及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CXCR4蛋白在前列腺癌(46例)、良性前列腺增生(15例)及正常前列腺組織(10例)中的表達(dá)，分析其與前列腺癌病理分級(jí)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)不同前列腺癌細(xì)胞系中CXCR4及磷酸化NDRG1(pNDRG1)表達(dá)差異。結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白在前列腺癌組織(30例)中過(guò)度表達(dá)，表達(dá)率為65.2%，其表達(dá)水平與前列腺癌病理分級(jí)及Gleason評(píng)分無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.081)，而CXCR4蛋白表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，前列腺癌轉(zhuǎn)移患者表達(dá)率明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。Western blotting法檢測(cè)在正常前列腺上皮細(xì)胞和不同前列腺癌細(xì)胞系中CXCR4及NDRG1蛋白表達(dá)不同，高轉(zhuǎn)移潛能的去勢(shì)抵抗前列腺癌細(xì)胞(PC3和DU145)中CXCR4表達(dá)較高，而作為轉(zhuǎn)移抑制因子的pNDRG1表達(dá)則明顯降低。結(jié)論趨化因子受體CXCR4及轉(zhuǎn)移抑制因子NDRG1可能參與調(diào)控前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，對(duì)前列腺癌的臨床診斷和治療有重要價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌；趨化因子受體4；N-myc下游調(diào)節(jié)基因1；轉(zhuǎn)移

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種發(fā)病率較高的男性惡性腫瘤，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是骨轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅老年患者生命健康。大量研究[1-5]證實(shí)，趨化因子及其受體在腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其中最關(guān)鍵的因子是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1/CXCL12)，它廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中并參與調(diào)節(jié)各種生理病理過(guò)程。趨化因子受體4(chemokine receptor 4, CXCR4)是CXCL12最重要的天然受體，兩者具有高度親和力，可形成CXCL12-CXCR4生物效應(yīng)軸，通過(guò)趨化因子濃度梯度促進(jìn)腫瘤發(fā)生器官特異性轉(zhuǎn)移[1]。分化相關(guān)基因(N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1)是N-myc下游調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，作為腫瘤抑制因子可以調(diào)控腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[2-3]。本研究通過(guò)觀察前列腺癌組織中CXCR4蛋白表達(dá)情況，探討其與前列腺癌惡性程度和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時(shí)研究在前列腺癌細(xì)胞系中CXCR4和磷酸化NDRG1蛋白的表達(dá)，明確其在前列腺癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

收集2010至2015年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院部分手術(shù)標(biāo)本及病理科存檔標(biāo)本，其中PCa 46例，前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)15例，正常前列腺組織(normal prostate，NP)10例。標(biāo)本來(lái)自前列腺癌根治術(shù)、前列腺穿刺活檢、前列腺摘除術(shù)、前列腺膀胱全切術(shù)及意外死亡者，均經(jīng)病理科醫(yī)師病理診斷證實(shí)。依照Gleason評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，46例PCa中包括高分化癌(Gleason評(píng)分2～4分)9例，中分化癌(Gleason評(píng)分5～7分)21例，低分化癌(Gleason8評(píng)分～10分)16例[4]。前列腺癌轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移)患者12例，無(wú)轉(zhuǎn)移患者34例。免疫組織化學(xué)及Western blotting法所用抗體為CXCR4及pNDRG1單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)BD及Cell Signaling公司。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)CXCR4在前列腺癌組織中的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步操作，在組織切片中加入一抗(CXCR4單克隆抗體)和二抗后，聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。結(jié)果判定：蛋白表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性物質(zhì)著色深淺及陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分為4級(jí)，高倍視野(200×)下計(jì)數(shù)，(-)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；(+)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%，染色較淺；(++)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%，棕黃色；(+++)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%，染色較深。

1.2.2免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)細(xì)胞中CXCR4及pNDRG1的蛋白表達(dá)

正常前列腺上皮細(xì)胞系PrEC(Clonetics公司，美國(guó))培養(yǎng)于培養(yǎng)基PrEGM中，人前列腺癌細(xì)胞系LNCap、PC3、DU145分別培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640 及DMEM培養(yǎng)基中，所有細(xì)胞均在飽和濕度、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。收集細(xì)胞后，提取總蛋白，分別取40 μg上樣，按常規(guī)方法行Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞CXCR4及pNDRG1的蛋白表達(dá)，ECL發(fā)光法顯色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用頻數(shù)表示，多組間比較用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，兩組間比較用Mann-Whitney檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色顯示，46例前列腺癌組織中，CXCR4蛋白表達(dá)陽(yáng)性者有30例，陽(yáng)性表達(dá)率為65.2%，明顯高于前列腺增生組織(陽(yáng)性表達(dá)率僅為13.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.210，P=0.000)。12例腫瘤轉(zhuǎn)移患者中有11例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率明顯高于非轉(zhuǎn)移患者。顯微鏡下，CXCR4蛋白表達(dá)表現(xiàn)為陽(yáng)性著色主要位于前列腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，呈淡黃色至棕黃色(圖1)。而10例正常前列腺組織中僅1例可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，與前列腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.023，P=0.005)，但是與前列腺增生組織中的陽(yáng)性表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。通過(guò)分析CXCR4蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達(dá)水平與前列腺癌的病理分級(jí)和Gleason評(píng)分無(wú)顯著相關(guān)性 (P=0.081)；而CXCR4蛋白表達(dá)與前列腺癌是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，轉(zhuǎn)移組顯著高于非轉(zhuǎn)移組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.002)，詳見(jiàn)表1。

Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示在前列腺正常上皮細(xì)胞中CXCR4蛋白無(wú)明顯表達(dá)，在激素依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞LNCap中CXCR4表達(dá)較弱，而在惡性程度較高的去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞PC3及DU145中表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明CXCR4可能與細(xì)胞的惡性程度明顯相關(guān)。然而，腫瘤抑制因子pNDRG1表達(dá)恰好相反，在正常前列腺PrEC細(xì)胞和低轉(zhuǎn)移潛能的LNCap細(xì)胞中表達(dá)較高，但在具有明顯轉(zhuǎn)移潛能的PC3和DU145細(xì)胞中表達(dá)缺失，說(shuō)明CXCR4及pNDGR1表達(dá)水平與前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(圖2)。

表1　PCa中CXCR4蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

圖1　免疫組織化學(xué)檢測(cè)CXCR4蛋白在組織中的表達(dá)情況

A： Expression of CXCR4 protein was negative in NP (×200)； B： Expression of CXCR4 protein was negative in BPH (×200)； C： Expression of CXCR4 protein was positive in PCa (×200)； D： Expression of CXCR4 protein was positive in PCa (×400); CXCR4:chemokine receptor 4; BPH:benign prostatic hyperplasial NP:normal prostate.

圖2　Western blotting法檢測(cè)CXCR4及pNDRG1

CXCR4:chemokine receptor 4; NDRG1:N-myc downstream regulated gene 1.

3討論

趨化因子是細(xì)胞因子超家族成員中一大類(lèi)具有化學(xué)趨化作用的分泌型小分子多肽(相對(duì)分子質(zhì)量為 8～15 000)，根據(jù)N端半胱氨酸殘基(Cys)的數(shù)量及前兩個(gè)半胱氨酸空間排列不同可將趨化因子分為4類(lèi)： C、CC、CXC和CX3C類(lèi)。而趨化因子受體屬于7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCR)超家族，其N(xiāo)端區(qū)域與配體結(jié)合，胞內(nèi)區(qū)與G蛋白偶聯(lián)，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。最初認(rèn)為趨化因子及受體結(jié)合具有激活和趨化白細(xì)胞的作用，但隨后發(fā)現(xiàn)它廣泛參與免疫應(yīng)答、感染、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化凋亡及細(xì)胞遷移等生理病理過(guò)程，尤其在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越受到重視。目前認(rèn)為參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移最重要的趨化因子是CXCL12[6]，它作為配體能激活CXCR4誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞骨架重排，促使腫瘤細(xì)胞緊密黏附于血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)定向性遷移到靶組織，所以CXCL12-CXCR4生物效應(yīng)軸在介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞靶向遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，兩者均在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)[7]。

NDRG1是N-myc下游調(diào)節(jié)基因，相對(duì)分子質(zhì)量為43 000，包含394個(gè)氨基酸，有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，碳端有3個(gè)特有的10個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)序列，可以被蛋白激酶A磷酸化。NDRG1對(duì)細(xì)胞的增生、分化、生長(zhǎng)及應(yīng)激反應(yīng)等起重要作用[8]。近年來(lái)，NDRG1作為轉(zhuǎn)移抑制因子的作用和功能越來(lái)越受到關(guān)注，可能與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有報(bào)道[9]，免疫組織化學(xué)證實(shí)了NDRG1蛋白在前列腺癌細(xì)胞膜中的表達(dá)顯著降低，其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)。

前列腺癌是老年男性常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，晚期腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是臨床中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，往往因治療失敗而導(dǎo)致患者死亡。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)CXCR12受體CXCR4在前列腺癌組織中高表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率為65.2%，可能是前列腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，具有重要的臨床診斷價(jià)值。通過(guò)進(jìn)一步分析CXCR4蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達(dá)水平與前列腺癌的Gleason評(píng)分并無(wú)顯著相關(guān)性，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]報(bào)道一致；然而CXCR4蛋白表達(dá)與前列腺癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，轉(zhuǎn)移患者陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于非轉(zhuǎn)移患者，因此CXCR4可能是促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素。同時(shí)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在高惡性和轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)較高，而磷酸化NDRG1表達(dá)明顯減少，也說(shuō)明了趨化因子受體CXCR4可能與腫瘤抑制因子NDRG1表達(dá)密切相關(guān)，共同參與了前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。目前，有文獻(xiàn)[14-17]報(bào)道通過(guò)阻斷CXCR4，能明顯降低前列腺癌細(xì)胞的侵襲潛能，抑制前列腺癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，為治療前列腺癌的轉(zhuǎn)移提供了可能。 Liu等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-182能通過(guò)下調(diào)NDRG1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增生，增加細(xì)胞侵襲性，促進(jìn)細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換，說(shuō)明NDRG1表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的惡性表型，是調(diào)控腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子。因此，CXCR4及NDRG1不僅有助于腫瘤的臨床診斷和預(yù)后判定，還有可能成為治療前列腺癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，CXCR4及NDRG1可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，尤其是對(duì)前列腺癌的轉(zhuǎn)移有重要調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)表明前列腺癌細(xì)胞中CXCR4及NDRG1之間可能存在密切的關(guān)系，但兩者之間的相互作用機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究探索，闡明兩者之間的關(guān)系和作用機(jī)制必將對(duì)前列腺癌的診斷和治療有重要意義。

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編輯慕萌

Expression of CXCR4 and NDRG1 and its association with invasion and metastasis in prostate cancer

Ping Hao, Niu Yinong, Yang Feiya, Wang Mingshuai, Xing Nianzeng

(DepartmentofUrology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of CXCR4 and N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1) in prostate cancer (PCa), and explore the relation between the protein expression and metastasis in PCa. MethodsThe expression of CXCR4 was detected by immunohistochemistry in 46 cases of PCa, 15 cases of benign prostatic hyperplasia (BPH) and 10 cases of normal prostate tissues (NP). The relation between the expression and clinicopathological changes was analyzed statistically. CXCR4 and phosphorylated NDRG1 (pNDRG1) were examined by Western blotting in prostate cancer cells. ResultsThe expression level of CXCR4 in PCa was significantly higher than those in BPH and NP. The over-expression rate of CXCR4 in PCa was 65.2%. The expression of CXCR4 protein was not significantly associated with pathological grade and Gleason score (P=0.081). However, the increased expression of CXCR4 protein was significantly associated with the presence of metastasis of PCa (P=0.002). By Western blotting analysis, the expression of CXCR4 protein was stronger in PC3 and DU145 than in PrEC and LNCap cell lines. However, the expression of pNDRG1 decreased in the prostate cancer cells with high metastasis potential. ConclusionThe expressions of CXCR4 and pNDRG1 are closely related to metastasis of PCa. CXCR4 and pNDRG1 have significant clinical implications for diagnosis and treatment of PCa.

【Key words】prostate cancer; chemokine receptor 4 (CXCR4); N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1); metastasis

基金項(xiàng)目：首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床科研合作基金(16JL60)。This study was supported by Capital Medical University Foundation-Clinical Research Cooperation Fund(16JL60).

*Corresponding author， E-mail：pinghaocy@163.com

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.014]

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 737.25

(收稿日期：2016-04-06)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-0719∶01網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1901.038.html

· 前列腺癌發(fā)病機(jī)制與臨床治療研究 ·