李保明　華正根　王洪慶　劉 超　李 曄　陳若蕓*（. 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室 中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院藥物研究所，北京 00050；. 福建仙芝樓生物科技有限公司 國家食用菌加工技術研發(fā)分中心 福建省藥用菌工程研究中心，福州 35000）

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不同生長期靈芝子實體三萜酸和多糖含量測定

李保明1華正根2王洪慶1劉 超1李 曄2陳若蕓1*
（1. 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室 中國醫(yī)學科學院 北京協和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050；2. 福建仙芝樓生物科技有限公司 國家食用菌加工技術研發(fā)分中心 福建省藥用菌工程研究中心，福州 350002）

摘 要分別采用HPLC法和藥典法測定不同生長期靈芝子實體中三萜酸和靈芝多糖的含量。HPLC法色譜條件：色譜柱為Alltech Alltima C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.04%甲酸溶液，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫15 ℃。結果：靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D和靈芝酸C1的線性范圍為5.9～42.0 μg/mL，r為0.999，加樣回收率為96.42%～104.14%。表現方法可行、重現性好，能定量測定靈芝中三萜酸和多糖的含量。

關鍵詞靈芝；生長期；三萜酸；多糖；含量測定

靈芝（Ganoderma lucidum）為靈芝科靈芝屬藥用真菌，在我國有廣泛、大量的栽培。研究人員從靈芝屬真菌中分離到了近400種化合物，但其活性成分主要為三萜和多糖類化合物［1］，為了更深入地了解靈芝不同生長期三萜和多糖的含量，我們對生長在福建省武夷山基地的不同生長階段靈芝子實體的化學成分進行了測定，為靈芝的合理開發(fā)利用提供科學依據。

1　三萜酸測定

1.1供試材料

9種靈芝三萜酸對照品均由本實驗室提供，經IR、UV、NMR、MS等光譜鑒定，HPLC分析純度為98%以上；赤芝（Ganoderma lucidum）藥材來源于福建仙芝樓生物科技有限公司武夷山栽培基地。

1.2測定方法與結果［2］

（1）色譜條件。色譜柱：Alltech Alltima C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相為0.04%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件：0～10 min，乙腈20%→25%；10～20 min，乙腈25%→30%；20～50 min，乙腈 30%→30%；50～65 min，乙腈30%→38%；65～80 min，乙腈為38%。柱溫15℃；流速1.0 mL/min ；進樣量20 μL；檢測波長254 nm。

（2）對照品溶液的制備。精密稱取靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1對照品適量，加甲醇溶解并制成約50 mg/L的對照品溶液。

（3）樣品溶液的制備。取靈芝子實體粉末（過2號篩）0.5 g，精密稱定，加入甲醇100 mL，加熱回流1小時，冷卻后過濾，濃縮至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取濾液，作為供試品溶液。

（4）方法學考察。①線性關系考察：精密吸取濃度為50 mg/L的對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.0、1.5 mL置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μL，注入色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積；以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標進行線性回歸，得靈芝酸C2回歸方程為Y=0.921 X-0.285，r=0.9992；靈芝酸G 為Y=1.28 X-2.15，r=0.9992；靈芝烯酸B 為Y=1.90 X-12.8，r=0.9994；靈芝酸B為Y =1.24 X+1.29，r=0.9992；靈芝烯酸A為Y= 2.60X-4.30，r=0.9992；靈芝酸A為Y=1.27 X +16.3，r=0.9995；靈芝酸D為Y=1.33 X+4.51，r=0.9990；靈芝烯酸D為Y=2.70 X-17.1，r= 0.999 2；靈芝酸C1為Y=1.16 X+8.41，r=0.9994。表明靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1分別為0.136～0.818 μg、0.128～0.765 μg、0.135～0.810 μg、0.128～0.765 μg、0.119～0.713 μg、0.118～0.705 μg、0.140～0.840 μg、0.124～0.743 μg、0.121～0.728 μg，與峰面積呈良好的線性關系。

②精密度試驗：取樣品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣20 μL，計算靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1峰面積的RSD分別為0.53%、0.89%、0.45%、0.48%、0.67%、1.2%、0.53%、0.53%和 1.1%。說明儀器精密度良好。

③穩(wěn)定性試驗：取樣品溶液，按上述色譜條件分別在0、4、8、12、24 h進樣，進樣量為20 μL，計算靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸 D、靈芝酸 C1峰面積的 RSD分別為0.63%、0.85%、0.62%、0.76%、0.86%、1.3%、0.56%、0.73%和1. 2%。說明樣品在24 h內穩(wěn)定。

④重現性試驗：取段木靈芝粉末6份，按“1.2 （3）”項的方法平行制取樣品溶液并測定，靈芝酸C2、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、靈芝烯酸A、靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝烯酸D、靈芝酸C1的峰面積的RSD分別為2.2%、0.41%、3.4%、2.1%、3.1%、0.53%、3.3%、0.39%和1.7%，重復性良好。

⑤回收率試驗：取已知含量的靈芝粉末5份，分別精密適量加入9種對照品混合溶液，按照樣品測定項下方法測定，計算回收率。結果其平均回收率分別為 102.14%、102.29%、100.64%、103.27%、104.14%、103.19%、96.42%、102.46%、101.50%，RSD為1.5%、0.96%、1.8%、1.3%、1.7%、2.5%、0.62%、2.9%和1.3%。

（5）樣品溶液三萜酸含量的測定。在已選定的色譜條件下進樣20 μL按外標法定量，分別計算樣品中三萜酸的含量，結果見表1。

表1　不同生長期靈芝樣品中的三萜酸含量

2　多糖的測定

2.1測定方法［3］

（1）對照品溶液的制備。取葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.1 mg的對照溶液。

（2）標準曲線的制備。分別精密量取對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1 g，加80%的硫酸溶液100 mL使溶解，搖勻）6 mL，搖勻，置水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應的試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在625 nm處測定波長為橫坐標，繪制標準曲線。

（3）樣品溶液的制備。取靈芝子實體粉末2 g，精密稱定，置于索氏提取器中，加水90 mL，加熱回流提取至提取液無色，提取液轉移至 100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取10 mL，加入乙醇150 mL，搖勻，4 ℃放置12 h，取出，離心，傾去上清液，沉淀加水溶解，轉移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

（4）樣品測定。精密量取樣品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標準曲線的制備方法測定，按標準曲線計算樣品溶液中含葡萄糖的量。

2.2不同生長期靈芝樣品的多糖含量測定結果

生長期1的多糖含量為0.874%；生長期2的多糖含量為0.424%；生長期3的多糖含量為0.426%；生長期4的多糖含量為0.284%；生長期5的多糖含量為0.149%；生長期6的多糖含量為0.387%。

3　討 論

從測定的結果看，同一品種的靈芝子實體在不同的生長期三萜酸的含量有較大差異，其中，第7天含量最高，第14天和第7天基本一致，而在第210天后有明顯下降，降幅達到50%；多糖含量也是第7天最高，第14天明顯下降，降幅達到50%。從試驗結果可以看出，三萜酸和多糖的含量隨著生長期的延長有同樣下降的趨勢，可能的原因是靈芝子實體的木質部生長比較快，子實體重量增加比較多，而化合物積累比較慢，所以含量出現下降。實際栽培中，在靈芝子實體生成原基階段，會將弱小、多余的原基剪切掉，只留1個強壯的原基長成子實體。這些剪切下的原基，三萜酸和多糖含量都比較高，可以作為靈芝精粉或保健品的提取原料加以利用。

參考文獻

［1］ 林志彬主編. 靈芝的現代研究［M］. 第四版， 北京: 北京大學醫(yī)學出版社， 2015.

［2］ 李保明， 古海鋒， 李曄， 等. HPLC測定不同產地靈芝中9種三萜酸 ［J］. 中國中藥雜志， 2012， 37（23）: 3599-3603.

［3］ 中華人民共和國藥典2015版一部［M］. 第1版， 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015: 188-189.

*為通訊作者

中圖分類號：S646

文獻標識碼：A

文章編號：2095-0934（2016）01-051-03