叢培瑋，尚 冰，王艷杰，趙丹玉，張 林，王德山

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·論著·

脾氣虛和脾陽虛模型大鼠腦腸肽與下丘腦葡萄糖轉(zhuǎn)運體1及葡萄糖轉(zhuǎn)運體3表達(dá)水平變化的實驗研究

叢培瑋，尚 冰，王艷杰，趙丹玉，張 林，王德山

110847 遼寧省沈陽市，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心(叢培瑋)，中醫(yī)文獻(xiàn)研究院(尚冰)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(王艷杰，趙丹玉，張林，王德山)

【摘要】目的分析脾虛模型大鼠腦腸肽〔β-內(nèi)啡肽(β-EP)、膽囊收縮素(CCK)、血管活性肽(VIP)〕、下丘腦葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT)1、GLUT3表達(dá)水平變化。方法2015年3—9月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只SPF級雄性SD大鼠分為對照組、脾氣虛組、脾陽虛組，每組8只。脾氣虛模型的建立采用飲食失節(jié)結(jié)合勞倦過度的原則，脾陽虛模型則是在脾氣虛的基礎(chǔ)上施加苦寒瀉下法完成。觀察3組大鼠一般情況(體征狀態(tài)、體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量等)及前肢抓力。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法測定下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA表達(dá)水平，Western blotting法測定下丘腦GLUT1、GLUT3表達(dá)水平。結(jié)果脾氣虛組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、前肢抓力低于對照組(P<0.05)；脾陽虛組大鼠體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量、前肢抓力低于對照組(P<0.05)；脾陽虛組大鼠體溫低于脾氣虛組(P<0.05)。脾氣虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平低于對照組，胃、空腸β-EP表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸CCK、VIP表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)；脾陽虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平低于對照組，胃、空腸β-EP、CCK表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸VIP表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)；脾陽虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平及下丘腦、空腸CCK表達(dá)水平低于脾氣虛組，胃、空腸β-EP表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸VIP表達(dá)水平高于脾氣虛組(P<0.05)。脾氣虛組、脾陽虛組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于對照組(P<0.05)；脾陽虛組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于脾氣虛組(P<0.05)。結(jié)論脾虛狀態(tài)下，大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平下降，導(dǎo)致下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平異常，這可能是脾虛本質(zhì)研究的又一新觀點。

【關(guān)鍵詞】脾氣虛；脾陽虛；腦腸肽；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)；下丘腦

叢培瑋，尚冰，王艷杰，等.脾氣虛和脾陽虛模型大鼠腦腸肽與下丘腦葡萄糖轉(zhuǎn)運體1及葡萄糖轉(zhuǎn)運體3表達(dá)水平變化的實驗研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(18)：2201-2205.[www.chinagp.net]

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近代研究發(fā)現(xiàn)，由腦的各級中樞和脊髓接受內(nèi)外環(huán)境變化時傳入的各種信息，經(jīng)過整合，再由自主神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)將其調(diào)控信息傳送到腸神經(jīng)系統(tǒng)或直接作用于胃腸效應(yīng)細(xì)胞，這種在不同層次將胃腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來的神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)稱為腦腸神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)或腦腸軸，而其中發(fā)揮實質(zhì)作用的相關(guān)物質(zhì)被醫(yī)學(xué)界稱為腦腸肽[1-2]?，F(xiàn)代臨床試驗及大量科研實驗發(fā)現(xiàn)，脾虛患者及脾虛動物模型在腦腸神經(jīng)方面均有不同程度的變化，這些結(jié)果進(jìn)一步證實了腦腸神經(jīng)系統(tǒng)可通過中樞水平調(diào)節(jié)胃腸功能[3]。

下丘腦是大腦與腦腸神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的最后通道，其神經(jīng)活動必須不斷依靠葡萄糖供能方能維持正常，血糖供應(yīng)不足會使神經(jīng)功能受損[4]，因此血糖維持在相對穩(wěn)定的正常水平極為重要。細(xì)胞對葡萄糖的攝取需要通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體(glucose transporter，GLUT)來完成，下丘腦表達(dá)的主要有GLUT1和GLUT3[5]。

脾因其“后天之本、氣血生化之源”的地位，常被認(rèn)為是人體生命活動、能量來源的基礎(chǔ)保障[6]。由此本研究組推斷，中醫(yī)脾虛在臨床出現(xiàn)的消化功能紊亂的病理特征可能是由于脾虛狀態(tài)下丘腦功能不足，導(dǎo)致大量通過腦腸神經(jīng)影響內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)的腦腸肽的合成分泌及功能調(diào)控出現(xiàn)異常變化。本研究觀察并分析脾氣虛、脾陽虛模型大鼠腦腸肽〔β-內(nèi)啡肽(β-endorphin，β-EP)、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、血管活性肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)〕、下丘腦GLUT1、GLUT3表達(dá)水平變化，為臨床脾虛治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物2015年3—9月選取SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(200±10)g，鼠齡5周，由本溪實驗動物中心提供﹝許可證號：SCXK(遼)2010-0001﹞。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心﹝許可證號：SYXK(遼)2013-000-9﹞。

1.2主要試劑和儀器總RNA提取(Trizol法)試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)試劑盒﹝寶生物工程(大連)有限公司﹞；兔抗大鼠GLUT1、GLUT3抗體(一抗)、羊抗兔IgG(二抗)(Abcam公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、蛋白濃度測定(BCA法)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；β-EP、CCK、VIP 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)；YLS-13A大小鼠抓力測定儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；7500 Real-time PCR儀(ABI公司)。

1.3動物分組、模型建立和評價采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠分為對照組、脾氣虛組、脾陽虛組，每組8只。脾虛動物模型建立及評價在課題組前期研究[7]的基礎(chǔ)上加以改良，條件為：室溫(20±2)℃，濕度(50±5)%，無拘束進(jìn)食飲水1周后正式造模。(1)對照組：大鼠每日無拘束進(jìn)食飲水，15 d。(2)脾氣虛組(飲食失節(jié)+勞倦型)：飽食1 d后禁食2 d，為1個循環(huán)，完成5個循環(huán)后造模結(jié)束，每日自由飲水；每日在35～37 ℃水箱中游泳至力竭，共15 d。(3)脾陽虛組(飲食失節(jié)+勞倦+苦寒瀉下型)：在脾氣虛基礎(chǔ)上，每日灌服20%番瀉葉水浸劑(2 ml/100 g)，早晚各1次，連續(xù)7 d。觀察3組大鼠一般情況(體征狀態(tài)、體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量等)及前肢抓力對模型進(jìn)行評價。

1.3.1體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量檢測測量3組大鼠體質(zhì)量、體溫后，放于代謝籠中，計算24 h進(jìn)食量。

1.3.2前肢抓力檢測按照YLS-13A大小鼠抓力測定儀說明書檢測前肢抓力，每只大鼠測量3次，取平均值。

1.4ELISA法測定下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平檢測前肢抓力后處死大鼠，取大鼠下丘腦、胃、空腸組織，操作方法按β-EP、CCK、VIP ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5Real-time PCR法測定下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA表達(dá)水平取大鼠下丘腦組織，利用Trizol法試劑盒提取下丘腦總RNA，保證RNA純度為1.8～2.2 nm。去基因組DNA，取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用Real-time PCR試劑盒進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性20 s，60 ℃退火35 s，共32個循環(huán)。采用7500 Real-time PCR儀檢測GLUT1、GLUT3 mRNA表達(dá)水平。引物序列：GLUT1上游引物為5′-TCCTGCTCATCAATCGTAA-3′，下游引物為5′-GACCCTCTTCTTTCATCTCC-3′；GLUT3上游引物為5′-GTGTCTCCCACTGCCCTAC-3′，下游引物為5′-AGCCCAGAATAAAGTCCAAA-3′；GAPDH上游引物為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.6Western blotting法測定下丘腦GLUT1、GLUT3表達(dá)水平取大鼠下丘腦組織，提總蛋白，采用BCA法試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取總蛋白80 μg采用SDS-PAGE試劑盒進(jìn)行電泳，150 V 30 min半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，常溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(稀釋比例均為1∶100)，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，15 min/次；加入二抗，室溫孵育1 h后TBST洗膜3次，15 min/次，化學(xué)發(fā)光法顯影。

2結(jié)果

2.1一般情況及前肢抓力比較對照組大鼠動作靈敏，皮毛光澤緊實，大便正常；脾氣虛組大鼠喜懶乏力，行動遲緩，皮毛蓬松無光澤，便軟；脾陽虛組大鼠倦怠明顯，反應(yīng)更為遲鈍，喜懶聚堆，皮毛枯槁，便稀溏。3組大鼠體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量、前肢抓力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脾氣虛組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、前肢抓力低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脾陽虛組大鼠體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量、前肢抓力低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脾陽虛組大鼠體溫低于脾氣虛組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平比較3組大鼠下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脾氣虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平低于對照組，胃、空腸β-EP表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸CCK、VIP表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脾陽虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平低于對照組，胃、空腸β-EP、CCK表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸VIP表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脾陽虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平及下丘腦、空腸CCK表達(dá)水平低于脾氣虛組，胃、空腸β-EP表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸VIP表達(dá)水平高于脾氣虛組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較3組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脾氣虛組、脾陽虛組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；脾陽虛組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于脾氣虛組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖1)。

Table 1Comparison of body mass,temperature,food-intake and forelimb grip among the three groups

組別只數(shù)體質(zhì)量(g)體溫(℃)進(jìn)食量(g)前肢抓力(g)對照組8314±1437.2±0.523±71563±208脾氣虛組8181±9a36.8±0.916±3a1206±173a脾陽虛組8174±20a34.4±0.4ab15±7a1149±180aF值23.927.874.8610.58P值<0.0010.010.04<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與脾氣虛組比較，bP<0.05

Table 3Comparison of mRNA and protein expression of GLUT1 and GLUT3 in hypothalamus among the three groups

組別只數(shù)GLUT1mRNAGLUT3mRNAGLUT1GLUT3對照組81.00±0.001.00±0.000.49±0.010.18±0.01脾氣虛組80.51±0.18a0.63±0.12a0.41±0.01a0.12±0.01a脾陽虛組80.08±0.01ab0.23±0.05ab0.31±0.01ab0.08±0.01abF值20.0727.5371.3526.30P值<0.01<0.001<0.001<0.01

注：與對照組比較，aP<0.05；與脾氣虛組比較，bP<0.05；GLUT=葡萄糖轉(zhuǎn)運體

注：GLUT=葡萄糖轉(zhuǎn)運體；1～3為脾陽虛組，4、5為對照組，6～8為脾氣虛組

圖1Western blotting法測定下丘腦GLUT1、GLUT3表達(dá)水平結(jié)果

Figure 1Expression levels of GLUT1 and GLUT3 in hypothalamus by Western blotting

表2　3組大鼠下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與脾氣虛組比較，bP<0.05；β-EP=β-內(nèi)啡肽，CCK=膽囊收縮素，VIP=血管活性肽

3討論

本研究脾氣虛模型的建立采用了飲食失節(jié)結(jié)合勞倦過度的原則，脾陽虛模型則是在脾氣虛的基礎(chǔ)上施加苦寒瀉下法完成[7]。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠動作靈敏，皮毛光澤緊實，大便正常；脾氣虛組大鼠喜懶乏力，行動遲緩，皮毛蓬松無光澤，便軟；脾陽虛組大鼠倦怠明顯，反應(yīng)更為遲鈍，喜懶聚堆，皮毛枯槁，便稀溏；脾氣虛組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、前肢抓力低于對照組，脾陽虛組大鼠體質(zhì)量、體溫、進(jìn)食量、前肢抓力低于對照組，脾陽虛組大鼠體溫低于脾氣虛組。以上結(jié)果表明，脾氣虛、脾陽虛模型復(fù)制成功。

中醫(yī)認(rèn)為，“脾臟”是飲食水谷之消化、吸收和精微物質(zhì)運輸布散功能的“綜合”單位[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生物體自身調(diào)控機(jī)制在神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)間存在復(fù)雜相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)間的信息傳遞大多依賴于細(xì)胞因子、激素、化學(xué)遞質(zhì)等物質(zhì)[9]。腦腸肽是具有特殊生物作用的肽類激素，雙重分布于胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對其雙向調(diào)節(jié)起著重要作用。近年來研究證實，腦腸肽在脾虛狀態(tài)下表達(dá)紊亂[2]。

本研究選取了廣泛存在于胃腸道及腦組織中，較有代表性的對胃腸消化、吸收、分泌、運動等功能有著重要調(diào)節(jié)作用的腦腸肽——β-EP、CCK、VIP。β-EP具有刺激胃酸和十二指腸近段HCO3-分泌、保護(hù)胃腸黏膜細(xì)胞分泌、影響胃腸運動等作用[10]。CCK具有收縮膽囊和刺激胰酶分泌、增強(qiáng)胰酶活性、刺激胃腸肌肉、促進(jìn)遠(yuǎn)端十二指腸和空腸的蠕動等功能[11]。VIP是神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對胃腸運動有抑制作用[12]。呂琳等[13]發(fā)現(xiàn)，脾虛模型大鼠胃、腸組織中的β-EP水平明顯高于同期對照組，而高秀蘭等[14]對脾虛發(fā)熱大鼠研究發(fā)現(xiàn)，大鼠外周血中CCK、β-EP水平有所升高，提示脾虛與β-EP、CCK等腦腸肽表達(dá)改變有密切的關(guān)系。張永東等[15]研究證實，四君子湯對脾虛模型鴨十二指腸、空腸CCK mRNA表達(dá)有較好的預(yù)防效果，提示CCK表達(dá)改變可能是脾虛的病理機(jī)制之一。李曉紅等[16]認(rèn)為，肝郁脾虛模型大鼠出現(xiàn)的胃黏膜血管收縮和胃過度蠕動等現(xiàn)象可能與腦組織VIP表達(dá)水平升高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，脾氣虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平低于對照組，胃、空腸β-EP表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸CCK、VIP表達(dá)水平高于對照組；脾陽虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平低于對照組，胃、空腸β-EP、CCK表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸VIP表達(dá)水平高于對照組；脾陽虛組大鼠下丘腦β-EP表達(dá)水平及下丘腦、空腸CCK表達(dá)水平低于脾氣虛組，胃、空腸β-EP表達(dá)水平及下丘腦、胃、空腸VIP表達(dá)水平高于脾氣虛組。提示β-EP、CCK及VIP可能參與脾虛的病理過程，即脾虛導(dǎo)致了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控物質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響了腦腸肽類物質(zhì)的功能調(diào)控，最終導(dǎo)致脾虛的病理狀態(tài)。但這些物質(zhì)在血液及組織中的表達(dá)卻體現(xiàn)或增高或降低的不同趨勢，詳盡原因有待進(jìn)一步研究。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，脾主運化，“運”即依賴于細(xì)胞膜上的各種轉(zhuǎn)運體協(xié)同作用，汲取營養(yǎng)物質(zhì)以提供能量[17-18]。腦組織獲取能量來源的唯一方式是糖代謝[19]。因此，葡萄糖是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要能源物質(zhì)。下丘腦作為大腦與腦腸神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的終末唯一通道，其碳水化合物物質(zhì)水平正常，才可保障腦腸神經(jīng)系統(tǒng)功能穩(wěn)定[4]。GLUTs家族(GLUT1～GLUT5)是細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要載體，在下丘腦中分布的主要有GLUT1和GLUT3，GLUT1是大腦內(nèi)第一個發(fā)現(xiàn)的GLUT，也是目前GLUTs家族唯一被純化且研究深入的一個成員[20]。GLUT1分布在血-腦脊液屏障的內(nèi)皮細(xì)胞上，負(fù)責(zé)將葡萄糖從血液跨血-腦脊液屏障轉(zhuǎn)運到腦細(xì)胞間隙；GLUT3是神經(jīng)元葡萄糖轉(zhuǎn)運體，負(fù)責(zé)將葡萄糖從細(xì)胞外間隙轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元內(nèi)。故常將GLUT1、GLUT3稱為腦型葡萄糖轉(zhuǎn)運體[21-22]。本研究結(jié)果顯示，脾氣虛組、脾陽虛組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于對照組，脾陽虛組大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平低于脾氣虛組，提示模型大鼠下丘腦GLUT表達(dá)水平的改變可能是脾虛對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響的病理機(jī)制之一。

本研究目前僅以葡萄糖在體內(nèi)不同部位的轉(zhuǎn)運機(jī)制為出發(fā)點對脾虛本質(zhì)展開研究，而這些GLUT是如何調(diào)控腦腸肽等一系列物質(zhì)對機(jī)體產(chǎn)生影響的，則有待進(jìn)一步研究加以探討。

綜上所述，脾虛狀態(tài)下，大鼠下丘腦GLUT1、GLUT3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平下降，導(dǎo)致下丘腦、胃、空腸β-EP、CCK、VIP表達(dá)水平異常，這可能是脾虛本質(zhì)研究的又一新觀點。

作者貢獻(xiàn)：叢培瑋進(jìn)行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；尚冰、王艷杰進(jìn)行實驗實施、評估、數(shù)據(jù)整理；趙丹玉、張林進(jìn)行實驗實施、審校；王德山負(fù)責(zé)總體審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Change of Expression Levels of Glucose Transporter-1 and Glucose Transporter-3 in Hypothalamus and Brain-gut Peptide of Spleen-qi Deficiency Rats and Spleen-yang Deficiency Rats

CONGPei-wei,SHANGBing,WANGYan-jie,etal.

TeachingandExperimentCenter,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China

【Abstract】ObjectiveAnalysis the changes of the expression levels of brain-gut peptide〔β-endorplhin(β-EP),cholecystokinin(CCK) and vasoactive peptide(VIP)〕 and glucose transporter-1(GLUT1) and glucose transporter-3(GLUT3) in hypothalamus of spleen deficiency rats.MethodsFrom March to September 2015,a total of 24 SPF male SD rats were divided into control group,spleen-qi deficiency group and spleen-yang deficiency group with 8 rats in each group by random number table method.The model rats of spleen-qi deficiency were built by immoderate diet and overfatigue;the model rats of spleen-yang deficiency were built by bitter and cold aloes on the basis of the model rats of spleen-qi deficiency.The three groups were observed by general information(signs and state,body mass,temperature and food-intake) and grip of forelegs.The expression levels of β-EP,CCK and VIP in hypothalamus,stomach and jejunum were assessed by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA);the mRNA levels of GLUT1 and GLUT3 were measured by real time quantitative fluorescent polymerase chain reaction(Real-time PCR);the levels of GLUT1 and GLUT3 in hypothalamus were measured by Western blotting.ResultsThe body mass,food-intake and grip of forelegs of spleen-qi deficiency group were lower than those of control group(P<0.05);the body mass, temperature, food-intake and grip of forelegs of spleen-yang deficiency group were lower than those of control group(P<0.05);the temperature of spleen-yang deficiency group was lower than that of spleen-qi deficiency group(P<0.05).The expression level of β-EP in hypothalamus of spleen-qi deficiency group was lower than that of control group(P<0.05);the expression level of β-EP in stomach and jejunum and the expression levels of CCK and VIP in hypothalamus,stomach and jejunum of spleen-qi deficiency group were higher than those of control group(P<0.05).The expression level of β-EP in hypothalamus of spleen-yang deficiency group was lower than that of control group and the expression levels of β-EP and CCK in stomach and jejunum and the expression level of VIP in hypothalamus,stomach and jejunum of spleen-yang deficiency group were higher than those of control group(P<0.05);the expression level of β-EP in hypothalamus and the expression level of CCK in hypothalamus and jejunum of spleen-yang deficiency group were lower than those of spleen-qi deficiency group and the expression level of β-EP in stomach and jejunum and the expression level of VIP in hypothalamus,stomach and jejunum of spleen-yang deficiency group were higher than those of spleen-qi deficiency group(P<0.05).The mRNA expression and protein expression of GLUT1 and GLUT3 in hypothalamus of spleen-qi deficiency group and spleen-yang deficiency group were lower than those of control group(P<0.05);the mRNA expression and protein expression of GLUT1 and GLUT3 in hypothalamus of spleen-yang deficiency group were lower than those of spleen-qi deficiency group(P<0.05).ConclusionUnder the condition of spleen deficiency,the mRNA expression levels of GLUT1 and GLUT3 in hypothalamus are lower and the expression levels of β-EP,CCK and VIP in hypothalamus,stomach and jejunum are abnormal,which may be a new viewpoint of studying the essence of spleen deficiency.

【Key words】Spleen-qi deficiency;Spleen-yang deficiency；Brain-gut peptide；Glucose transport protein;Hypothalamus

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)課題(2013CB531702)

通信作者：王艷杰，110847 遼寧省沈陽市，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；E-mail：15940157054@163.com

【中圖分類號】R 551.11

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.018

(收稿日期：2015-10-13；修回日期：2016-01-24)

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·