劉 帥，張 玲，加帕爾·哈斯木，宋迎春，張志新，康京麗，薛新梅，閆 雙，谷文喜，馬曉菁，葉 鋒，易新萍，鐘 旗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；3.新疆尉犁縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆尉犁 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆庫(kù)爾勒 841000；5.新疆哈密地區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆哈密 839000；6.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

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新疆牛群中鹿流行性出血熱血清學(xué)調(diào)查

劉 帥1，2，張 玲1，2，加帕爾·哈斯木3，宋迎春4，張志新5，康京麗6，薛新梅4，閆 雙2，谷文喜2，馬曉菁2，葉 鋒2，易新萍2，鐘 旗2

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；3.新疆尉犁縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆尉犁 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆庫(kù)爾勒 841000；5.新疆哈密地區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆哈密 839000；6.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

摘 要：本研究采用鹿流行性出血熱（EHD）cELISA診斷試劑盒分別對(duì)2014年和2015年6、7月份從新疆10個(gè)地（州、市）隨機(jī)采集的662份牛血清進(jìn)行了EHD檢測(cè)。結(jié)果檢出陽(yáng)性48份，陽(yáng)性率為7.25 %；檢出地區(qū)有：哈密市、巴里坤縣、伊吾縣、尉犁縣、岳普湖縣，其中哈密市和岳普湖縣的陽(yáng)性率較高，在20% 左右。這是首次對(duì)新疆部分地區(qū)進(jìn)行EHD血清學(xué)調(diào)查，檢測(cè)結(jié)果為今后新疆地區(qū)的EHD研究，特別是病原學(xué)方面研究提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鹿流行性出血熱；牛；cELISA；新疆

鹿流行性出血熱（Epizootic hemorrhagic disease of deer，EHD）是流行性出血熱病毒（Epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）以庫(kù)蠓為傳播媒介，引起鹿（尤其是白尾鹿）、牛、羊等多種反芻動(dòng)物體溫升高、厭食、黏膜和漿膜面廣泛出血，有時(shí)引起孕畜流產(chǎn)和休克致死的一種嚴(yán)重傳染病[1]。EHDV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，與藍(lán)舌病病毒有一定的親緣關(guān)系。該病于1955年首次在美國(guó)東部被發(fā)現(xiàn)，之后加拿大、尼日利亞、澳大利亞、菲律賓、留尼汪島、日本等[2-4]國(guó)家或地區(qū)相繼報(bào)道有EHDV存在。我國(guó)部分省份也在牛、羊血清中檢測(cè)到EHDV抗體，甚至成功從牛的抗凝血中分離到EHDV毒株[5]。新疆屬于溫帶大陸性干旱氣候，溫度、濕度、光照、水源等條件均適于該病傳播媒介庫(kù)蠓的棲息繁衍。自1990年新疆首次分離到藍(lán)舌病毒后，2014年王玉[6]也從尉犁縣監(jiān)控牛群中分離到了藍(lán)舌病毒，證實(shí)了庫(kù)蠓媒介病毒病在新疆長(zhǎng)期存在。這給新疆畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大的潛在威脅，因此EHD的調(diào)查研究對(duì)新疆畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)在2014年和2015年從新疆部分地區(qū)隨機(jī)采集的牛血清進(jìn)行EHD抗體檢測(cè)，來(lái)初步探查目前新疆EHD的流行情況。

1　材料

分別在2014年和2015年的6、7月份，從新疆烏魯木齊、巴州、哈密等10個(gè)地（州、市）隨機(jī)采集牛血清662份；鹿流行性出血熱病毒抗體檢測(cè)試劑盒（EHD cELISA），由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。其他儀器還有Biorad 680酶標(biāo)儀、96孔酶標(biāo)板等。

2　方法

嚴(yán)格按照鹿流行性出血熱病毒抗體檢測(cè)試劑盒（EHD cELISA）說(shuō)明書操作：統(tǒng)計(jì)樣品數(shù)量，確定所需EHDV抗原包被ELISA板（條）的數(shù)量，待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、弱陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照應(yīng)分別測(cè)量2孔；在抗原包被 ELISA板中加入40 μL稀釋液，隨后按每孔10 μL加入待測(cè)樣品和對(duì)照，充分震蕩混勻，在37 ℃溫箱溫育30 min；用稀釋液配制競(jìng)爭(zhēng)抗體工作液，每孔加50 μL，充分震蕩，在37 ℃溫箱溫育30 min；倒掉酶標(biāo)板里的液體，拍干，配制HPR酶標(biāo)二抗，每孔加入50 μL，震蕩，37 ℃溫箱溫育30 min；用PBST洗板5次，拍干；每孔加50 μL TMB液，顯色（15± 2）min；快速按每孔50 μL 加入終止液，用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。

計(jì)算抑制率、弱陽(yáng)性上限和下限值，再據(jù)此做出陰、陽(yáng)性判定（如果被檢樣品的抑制率大于或等于弱陽(yáng)性上限值，該樣品就可以被判為陽(yáng)性；如果被檢樣品的抑制率小于或等于弱陽(yáng)性下限值，該樣品就可以被判為陰性；如果被檢測(cè)樣品的抑制率在弱陽(yáng)性上限和下限之間，暫定為可疑，重復(fù)試驗(yàn)，如果結(jié)果相同，則判為弱陽(yáng)性，還可過(guò)一段時(shí)間后重新從動(dòng)物取樣再進(jìn)行檢測(cè)）。

3　結(jié)果

3.1部分EHD cELISA檢測(cè)結(jié)果（吸光值、抑制率）

如表1所示，該96孔酶標(biāo)板中：陰性對(duì)照平均A值為 1.0575 ，弱陽(yáng)性對(duì)照抑制率（PI）為65.34% ；弱陽(yáng)性上限值為 71.87 %，弱陽(yáng)性下限值為 58.81 %；檢測(cè)樣品 YL 8 和 YL 32 的抑制率（PI）分別為73.72 % 和 72.86 %，均大于弱陽(yáng)性上限值，判為陽(yáng)性。樣品 YL 26 的抑制率（PI）為 62.41 %，介于弱陽(yáng)性上限值和下限值之間，暫定為可疑樣品。再根據(jù)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，做出判定。

3.2檢測(cè)結(jié)果匯總

新疆部分地區(qū) 662份牛血清EHDV抗體檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。哈密市、巴里坤縣、伊吾縣、尉犁縣、岳普湖縣檢測(cè)出EHDV陽(yáng)性抗體共48份，平均陽(yáng)性率為7.25 %，其中哈密市和岳普湖縣牛的感染率較高，分別為21.11 % 和20 %。其余市（縣、區(qū)）未檢測(cè)出EHDV抗體。662份樣品采集地點(diǎn)分布如圖1所示，紅色標(biāo)記為檢出EHD陽(yáng)性樣品地區(qū)，藍(lán)色標(biāo)記為EHD陰性地區(qū)。

3.3伊吾縣、尉犁縣樣品檢測(cè)結(jié)果

如表3所示，2014年6月在伊吾縣隨機(jī)采樣90份，檢出EHDV抗體陽(yáng)性17份，陽(yáng)性率為18.89 %；2015年6月隨機(jī)采樣41份，未檢出EHDV抗體。2014年6月在尉犁縣隨機(jī)采樣50份，檢出EHDV抗體9份，陽(yáng)性率為18.00 %；2015 年6月隨機(jī)采樣30份，未檢測(cè)到EHDV抗體（2014年與2015年采樣動(dòng)物耳號(hào)不同，無(wú)重復(fù)采樣）。

表1　部分牛血清 EHD cELISA檢測(cè)結(jié)果（尉犁縣 44份）

表2　新疆部分地區(qū)牛EHD cELISA 檢測(cè)結(jié)果

圖1　樣品采集地點(diǎn)示意圖

表3　伊吾縣、尉犁縣樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

4　討論

本研究針對(duì)新疆10個(gè)地（州）的20個(gè)縣（市、區(qū)）共計(jì)662頭牛進(jìn)行了EHD cELISA檢測(cè)，其中陽(yáng)性48份、陰性614份，平均陽(yáng)性率為7.25 %。巴里坤縣、伊吾縣、哈密市、尉犁縣、岳普湖縣均有不同程度的牛EHDV感染，陽(yáng)性率分別為1.11%、12.98%、21.11%、11.25 %、20.00 %。而其它地區(qū)樣品未能檢測(cè)出EHDV抗體，可能與這些地區(qū)氣候、地理?xiàng)l件，如溫度、水泊、風(fēng)力、氣壓等因素不利于EHDV傳播媒介庫(kù)蠓的生長(zhǎng)繁殖，或是檢測(cè)樣品數(shù)量偏少有關(guān)。

檢出的48份陽(yáng)性樣品均采自2014年6、7月，2015年樣品全為陰性。其中伊吾縣和尉犁縣兩年都有采集樣品，2014年樣品陽(yáng)性率達(dá)到18.00 %，而2015年在相同地點(diǎn)、不同編號(hào)牛采集的血清中，未能檢測(cè)到EHDV抗體。新疆地區(qū)2015年天氣變化異常：春季、夏季區(qū)域性暴雨和局地強(qiáng)對(duì)流天氣多發(fā)，南北疆頻遭風(fēng)沙襲擊；氣溫升降頻率快，極端性強(qiáng)，遭遇了歷史罕見高溫天氣過(guò)程，接著寒潮又至；氣象災(zāi)害多發(fā)，暴雨洪澇災(zāi)害損失居歷史同期第二位。這些極端自然事件的多發(fā)，嚴(yán)重影響了庫(kù)蠓的生存繁殖，導(dǎo)致EHD感染率出現(xiàn)暫時(shí)性下降。

鹿流行性出血熱是我國(guó)規(guī)定的進(jìn)境動(dòng)物檢疫二類疫病。EHDV與藍(lán)舌病病毒高度相似，傳播媒介同為庫(kù)蠓。EHDV不同血清型的毒力有差異，同一血清型的毒力每年也在不斷的變化。有時(shí)牛感染后可以檢測(cè)到抗體，但不表現(xiàn)臨床癥狀[7]。疾病暴發(fā)區(qū)的動(dòng)物病死率可高達(dá)30%。該病目前尚無(wú)有效的疫苗和治療方法，暴發(fā)流行時(shí)會(huì)給畜牧業(yè)和國(guó)家貿(mào)易帶來(lái)巨大損失[8]。

新疆深居內(nèi)陸，遠(yuǎn)離海洋，屬溫帶大陸性氣候，晝夜溫差大，日照時(shí)間長(zhǎng)，阿爾泰山、天山、昆侖山的積雪、冰川孕育匯集了500多條河流湖泊，分布于天山南北盆地，加上有大量牛、羊等易感動(dòng)物的存在，這為庫(kù)蠓的繁衍、疾病的傳播等形成了有利條件。

庫(kù)蠓種類繁多，常孽生水塘、沼澤、樹洞、石穴的積水及蔭蔽的潮濕土壤，在夏季日出和日落時(shí)活動(dòng)最為頻繁，對(duì)水源、濕度、溫度、光照、風(fēng)等有一定的要求。EHD的流行分布情況與其媒介庫(kù)蠓的活動(dòng)情況呈正相關(guān)，主要分布在北緯40度和南緯45度之間。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，但隨著全球氣候變暖，該范圍有擴(kuò)大趨勢(shì)。

當(dāng)血液中出現(xiàn)EHDV中和抗體時(shí)（約于感染后6～8天），病毒血癥消失，所以抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)前2周是EHDV分離的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)?？梢栽贓HDV抗體陽(yáng)性率較高的地區(qū)設(shè)立EHDV抗體陰性動(dòng)物作為監(jiān)控群，取抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)前后2周內(nèi)的紅細(xì)胞接種于BHK-21細(xì)胞來(lái)分離EHDV。該方法雖費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但可大大提高病毒分離的成功率。也可采用庫(kù)蠓組織研磨液接種細(xì)胞的方法來(lái)分離EHDV。

本研究首次對(duì)新疆部分地區(qū)牛群中的鹿流行性出血熱進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，檢測(cè)結(jié)果表明新疆部分地區(qū)存在牛的鹿流行性出血熱感染。本研究結(jié)論為今后新疆地區(qū)鹿流行性出血熱的研究，特別是病原學(xué)研究方面提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

中圖分類號(hào)：S851.3 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A

文章編號(hào)：1005-944X（2016）04-0015-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.04.005

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“重要牛羊蟲媒病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”項(xiàng)目（201303035）；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生項(xiàng)目（xjaucxyyjs-20151019）

通訊作者：鐘旗

Serological Survey on Deer Epizootic Hemorrhagic Disease of Bovine in Xinjiang

Liu Shuai1，2，Zhang Ling1，2，Jiapaer Hasimu3，Song Yingchun4，Zhang Zhixin5，Kang Jingli6，Xue Xinmei4，Yan Shuang2，Gu Wenxi2，Ma Xiaojing2，Ye Feng2， Yi Xinping2，Zhong Qi2
（1. College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052；2. Institute of Veterinary Medicine，Xinjiang Acadamy of Animal Science，Urumqi，Xinjiang 830000；3. Yuli Animal Husbandry and Veterinary Station，Yuli，Xinjiang 841500；4. Animal Eppidemic Control and Diagnosis Center of Bayingol Mongolian Autonomous Prefecture，Korla，Xinjiang 841000；5. Animal Eppidemic Control and Diagnosis Center of Hami Prefecture，Kumul，Xinjiang 839000；6.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：This study was conducted by cELISA kits of epizootic hemorrhagic disease（EHD）on 662 bovine serum collected from 10 districts of Xinjiang area in the Summer of 2014 and 2015 to make a bovine serosurvey of EHD in Xinjiang. 48 samples from Hami，Balikun，Yiwu，Yuli and Yuepuhu were serology positive， with an average rate of 7.25%. The seroprevalence of bovine in Hami and Yuepuhu （about 20%）were obviously higher than others. This study was the fi rst serosurvey of EHD in Xinjiang，and indicated that EHD infection existed in parts of Xinjiang. The results provided a scientifi c basis for EHD future study，especially for its etiology research in Xinjiang area.

Key words：EHD；bovine；cELISA；Xinjiang