董曉宏, 馬曉冬, 余 晶, 吳毅平

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實(shí)驗(yàn)研究

SD大鼠自然衰老皮膚組織模型的檢測(cè)

董曉宏, 馬曉冬, 余 晶, 吳毅平

目的 通過比較4周齡年輕大鼠與18個(gè)月齡年老大鼠背部皮膚相關(guān)指標(biāo)的差異性，確定自然衰老大鼠皮膚模型的建立。方法 取年輕組和年老組大鼠背部皮膚組織，分別進(jìn)行組織學(xué)HE染色、Masson 染色和EVG染色，觀察皮膚組織學(xué)形態(tài)變化；計(jì)算皮膚組織中真皮層厚度、膠原纖維和彈力纖維的相對(duì)面積值，并進(jìn)行兩組間比較。測(cè)定皮膚組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)和皮膚羥脯氨酸(Hyp)的含量。結(jié)果 組織切片染色顯示，SD大鼠年老組較年輕組皮膚層厚度變薄，膠原纖維面積和彈力纖維面積均減少(n=5,P<0.05)。年老組皮膚組織中SOD和Hyp含量低于年輕組，而MDA含量則年老組高于年輕組(n=5,P<0.05)。結(jié)論 4周齡年輕組大鼠皮膚與18個(gè)月齡年老組大鼠皮膚存在較大差異，且年老組大鼠皮膚抗氧化能力下降，膠原纖維含量減少，染色變淺，彈力纖維減少、變形，有部分呈斷裂、纏結(jié)，可以作為自然衰老皮膚的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

自然衰老; 衰老皮膚; 超氧化物歧化酶; 過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛; 皮膚羥脯氨酸

皮膚衰老是一種長(zhǎng)期變化的過程，相關(guān)研究者提出了較有影響和代表性的學(xué)說，主要有內(nèi)源性的皮膚衰老包括：遺傳基因調(diào)控學(xué)說、組織代謝失調(diào)學(xué)說、氧自由基學(xué)說；外源性的皮膚衰老，包括：有光老化、生存環(huán)境、生活方式等學(xué)說[1-3]。研究和解決衰老等問題，需建立衰老的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過衰老的動(dòng)物模型來研究評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)、衰老的機(jī)制和抑制衰老的方法。對(duì)皮膚衰老的檢測(cè)，目前還沒有一種較為規(guī)范的評(píng)價(jià)體系，結(jié)合相關(guān)研究報(bào)道并總結(jié)衰老后的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，真皮內(nèi)的膠原蛋白、彈力纖維和相應(yīng)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、羥脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)和過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)等成分在皮膚衰老過程中，都有較明顯的變化[4]。自2015年9月，包頭市第四醫(yī)院整形外科設(shè)計(jì)用自然衰老實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行模擬人衰老皮膚模型，通過組織切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)，用特異性化學(xué)方法檢測(cè)皮膚組織中相關(guān)生化指標(biāo)的改變 。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)雌性SD大鼠，4周齡(70～80 g)、18個(gè)月齡(400～510 g)，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)與華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房。取材部位：SD大鼠脊柱兩側(cè)背部皮膚組織。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物檢測(cè) 按4周齡和18個(gè)月齡分為兩組：年輕組與年老組，每組5只SD大鼠，所有SD大鼠均為雌性。

1.2.2 皮膚組織取材 切取大鼠背部皮膚，一部分放入4%多聚甲醛中浸泡固定；另一部分皮膚組織塊稱取重量并進(jìn)行標(biāo)號(hào)、記錄，迅速放入無菌凍存管內(nèi)，保存在液氮中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。

1.2.3 衰老皮膚的形態(tài)學(xué)變化觀察 將浸泡在4%多聚甲醛中的皮膚組織標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm厚度的石蠟切片，分別進(jìn)行HE染色、Masson染色、EVG染色。檢測(cè)SOD、MDA、Hyp的含量，均采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.2.4 半定量檢測(cè) 由IPP專業(yè)圖像分析軟件在相同條件下，進(jìn)行皮膚厚度、膠原纖維和彈力纖維相對(duì)面積半定量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩組皮膚組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)比較

HE染色顯示：年輕組的皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，各組織間結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞有序排列；年老組的真皮層厚度減小，有部分角化層分布，組織層次較疏松，細(xì)胞雜亂排列。Masson 染色顯示：年輕組膠原纖維整齊排列、均勻分布，纖維染色清楚；年老組的膠原纖維雜亂，粗細(xì)不均等，纖維染色界限不清。EVG染色顯示：年輕組彈性纖維染色清晰，形態(tài)規(guī)則，界限清楚；年老組的彈性纖維較少，分布不規(guī)則，形態(tài)不等。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,P<0.05)。見表1，圖1～3。

2.2 兩組大鼠皮膚生化指標(biāo)數(shù)據(jù)比較

年老組的SOD和Hyp含量均明顯低于年輕組的數(shù)值，而年老組的MDA的含量卻高于年輕組的表達(dá)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,P<0.05)。見表2。

表1 兩組皮膚形態(tài)學(xué)指標(biāo)比較

表2 兩組皮膚生化指標(biāo)比較

3 討論

人類皮膚在自然衰老的過程中，受內(nèi)源性和外源性多種因素的影響，所獲得的衰老皮膚模型很難排除其他非相關(guān)性的干擾因素，同時(shí)還存在醫(yī)學(xué)倫理學(xué)等對(duì)實(shí)驗(yàn)規(guī)范的要求。故本課題實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇18個(gè)月齡雌性SD大鼠，檢測(cè)SD大鼠皮膚自然衰老過程中皮膚組織形態(tài)的變化和相關(guān)生化指標(biāo)的變化情況[5]，由此來確定皮膚衰老模型的建立。

皮膚的衰老從組織形態(tài)學(xué)上觀察，可體現(xiàn)在衰老皮膚的表皮釘變淺和減少，表皮與真皮層交界處鏈接較平坦，衰老皮膚組織內(nèi)細(xì)胞間連接較疏松，角質(zhì)層增厚，以及含水量減低(RO Potts, 1984年；W Montagna, 1979年)。在衰老皮膚內(nèi)，膠原纖維和彈力纖維網(wǎng)狀層排列的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形態(tài)也變得不規(guī)則。由于膠原纖維和彈力纖維的退化導(dǎo)致了皮膚的松弛，從而增加了皮膚皺褶(IM Braverman, 1982年)。

圖1 真皮厚度(HE ×40) a. 年輕組 b. 年老組 圖2 膠原纖維含量(Masson ×200) a. 年輕組 b. 年老組 圖3 彈力纖維含量(EVG ×400) a. 年輕組 b. 年老組

Fig 1 Dermal thickness (HE ×40). a. young group. b. aged group. Fig 2 Collagen fiber content (Masson ×200). a. young group. b. aged group. Fig 3 Elastic fibers content (EVG ×400). a. young group. b. aged group.

皮膚組織內(nèi)膠原蛋白中Hyp約占13.4%，而在彈性纖維中確較少。組織內(nèi)其他蛋白中不存在Hyp，而膠原蛋白主要分布在皮膚、軟骨、肌肉和血管等處；Hyp的含量隨身體的發(fā)育而增長(zhǎng)，可以從尿液中排出體外，待機(jī)體停止發(fā)育后，Hyp的含量趨于穩(wěn)定，故年老比年輕皮膚中Hyp的含量減少。因而，檢測(cè)Hyp的含量，可以間接地反應(yīng)因膠原纖維代謝所引發(fā)的結(jié)締組織疾病。所以，測(cè)定皮膚組織中Hyp的含量，可以評(píng)價(jià)皮膚衰老治療前后的變化情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4周齡與18個(gè)月齡雌性SD大鼠的皮膚組織相關(guān)檢測(cè)有明顯的差異性，證明18個(gè)月齡SD大鼠可作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的衰老模型。

對(duì)比兩組不同鼠齡的皮膚組織檢測(cè)指標(biāo)，由結(jié)果可知，其皮膚組織學(xué)切片在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)有非常特異性的不同；SOD、Hyp和MDA3種酶學(xué)指標(biāo)含量，在年輕組與年老組檢測(cè)顯示其含量有較大差別；檢查結(jié)果通過統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析顯示，有明顯的差異性，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，總結(jié)相關(guān)實(shí)驗(yàn)限定條件可以得出，18個(gè)月齡雌性SD大鼠自然衰老的皮膚模型可以成立。

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Detection of the natural aging skin tissue model in SD rats

DONGXiao-hong,MAXiao-dong,YUJing,WUYi-ping.

(DepartmentofPlasticSurgery,TheFourthHospitalofBaotou,Baotou014030,China)

WUYi-ping,Email:us_ypw@hotmail.com

Objective By comparing the difference of the relevant index in dorsal skin between the young rats (four weeks) and aged rats (eighteen months), the natural aging rat skin model was established. Metho-ds The dorsal skin of four-week-old young rats and eighteen-month-old aged rats was cut, for histological HE staining, Masson staining, and EVG staining to observe morphological changes. The thickness of the subcutaneous dermis, composition of collagenous fiber and elastic fibers in the skin were compared between the two groups of rats. The activity of superoxide dismutase (SOD), content of lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) and hydroxyproline (Hyp) in the skin tissue of the two groups were tested and compared. Results Histological staining shows that the skin is thinner and the elasticity fibrin is less in the aged group than that in the young group. The difference is statistically significant (P<0.05,n=5).ThecontentoftheSODandhydroxyprolineinskinishigherintheyounggroupthanthatintheagedgroup,andthecontentofMDAishigherintheagedgroupthanthatintheyounggroup.Thedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.05,n=5). Conclusion There are great differences between the skin of rats at eighteen months and four weeks. In the aged group, the antioxidant ability decreased, the content of collagen fiber was lower, indicated by lighter staining. The elasticity of fibers was decreased and deformed with some breaking and entanglement, indicating that rats can be used as an experimental animal model for natural aging skin.

Natural aging； Aging skin； Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Hydroxyproline

014030 內(nèi)蒙古 包頭，包頭市第四醫(yī)院 整形外科(董曉宏,馬曉冬);華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院 整形美容外科(余 晶, 吳毅平) 第一作者：董曉宏(1976-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，副主任醫(yī)師，碩士研究生. 通信作者：吳毅平，430030，華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院 整形美容外科，電子信箱：us_ypw@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.12.015

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A

1673-7040(2016)12-0752-04

2016-06-06)