楊清建，畢 波，陳 亮，曾繼平，楊 平，周軼群，郭 妤，朱晶晶，朱寧文，劉天一

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脂肪移植及研究

小鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞因子蛋白質(zhì)組學(xué)分析

楊清建，畢 波，陳 亮，曾繼平，楊 平，周軼群，郭 妤，朱晶晶，朱寧文，劉天一

目的 比較ADSCs和皮膚成纖維細(xì)胞(FBs)分泌細(xì)胞因子的差異。方法 體外培養(yǎng)小鼠ADSCs和皮膚FBs，提取ADSCs和FBs的胞漿蛋白，利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞因子表達(dá)量，通過數(shù)據(jù)分析軟件分析兩者之間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的主要細(xì)胞因子。結(jié)果 共有31種細(xì)胞因子僅ADSCs分泌，F(xiàn)Bs不分泌；ADSCs分泌占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞因子共20種。VEGF、FGF-21等在ADSCs裂解液中含量明顯多于在FBs裂解液中含量(P<0.05),HGF、PDGF-C等僅在ADSCs裂解液中檢測(cè)到。結(jié)論 ADSCs與FB分泌的細(xì)胞因子之間有明顯差異。與FBs相比，ADSCs能夠分泌更多種類的細(xì)胞因子。

脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞； 成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞因子； 蛋白質(zhì)組學(xué)分析； 小鼠

筆者前期研究結(jié)果顯示，ADSCs裂解液對(duì)光老化成纖維細(xì)胞具有延緩衰老、抗氧化等保護(hù)作用。為進(jìn)一步闡明ADSCs中哪些細(xì)胞因子可能會(huì)對(duì)光老化成纖維細(xì)胞起到保護(hù)作用，自2014年4月至2014年7月，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院整形外科比較了ADSCs和皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblasts， FBs)中細(xì)胞因子的差異，以期為進(jìn)一步研究提供理論支持及線索。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

SPF級(jí)1周齡C57 BL/6小鼠30只，雌雄不限，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(美國HYCLONE公司)，胎牛血清、雙抗(美國GIBCO公司)，RIPA裂解液(武漢碧云天生物技術(shù)研究所)，BCA試劑盒(美國PIERCE公司)，AAM-BLG-1試劑盒(美國RAYBIOTECH公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ADSCs和FBs的分離、培養(yǎng) 采用文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典ADSCs獲取和培養(yǎng)擴(kuò)增方法[1-2]，具體操作步驟如下：無菌條件下，取出小鼠腹股溝區(qū)脂肪團(tuán)塊，剪碎后置于0.1%Ⅰ型膠原酶消化液中，37 ℃下消化45 min，1500 r/min離心5 min, 棄去上清液，接種于低糖DMEM培養(yǎng)基(加入10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3 d后傳代1次，取P1代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別取3個(gè)小鼠的ADSCs，分別編號(hào)為ADSCs-E1、ADSCs-E2、ADSCs-E3。

另于無菌條件下，用眼科剪剪取背部皮膚，置于含0.2%dispase酶的培養(yǎng)液中，在4 ℃環(huán)境下過夜。分離真皮層，棄去表皮，將真皮組織剪碎后置于0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液中，37 ℃下消化60 min，1500 r/min離心5 min,棄去上清液，接種于DMEM培養(yǎng)基(加入10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d后傳代1次，取P1代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。編號(hào)為FB-E。

1.3.2 獲取細(xì)胞裂解液 待培養(yǎng)皿中細(xì)胞長滿后，此時(shí)細(xì)胞數(shù)目約為4×106～5×106/皿，用PBS沖洗2遍，加入RIPA裂解液(強(qiáng))500 μl(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1 mmol/L PMSF)。冰浴5 min，收集裂解液至1.5 ml EP管，并輕輕吹打，使細(xì)胞充分裂解。于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，即為細(xì)胞裂解液，保存在-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.3 蛋白芯片檢測(cè)細(xì)胞因子 細(xì)胞裂解液經(jīng)透析后，應(yīng)用BCA法(美國PIERCE公司，貨號(hào)23227)測(cè)定裂解液蛋白濃度。而后對(duì)樣本進(jìn)行生物素標(biāo)記。標(biāo)記方案見表1。用激光掃描儀Axon GenePix 4000 B Microarray Scanner(美國MOLECULAR DEVICES)掃描信號(hào)，采用綠色通道掃描，掃描參數(shù)為PMT：650；Wavelength：532 nm；resolution：10 μm。并用儀器自帶分析軟件提取數(shù)據(jù)，采用AAM-BLG-1的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)為測(cè)得的信號(hào)值，組間比較采用單樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠ADSCs和FBs的形態(tài)學(xué)特征

小鼠ADSCs培養(yǎng) 24 h后，Olympus倒置顯微鏡下可見大部分細(xì)胞已貼壁生長，呈成纖維細(xì)胞樣，原代培養(yǎng)至3 d左右，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳至P1代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或三極形，呈旋渦狀生長(圖1)；

小鼠FBs培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下可見大部分細(xì)胞已貼壁，呈典型成纖維細(xì)胞樣，原代培養(yǎng)至2 d左右，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合，此時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳至P1代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈三極形，不呈旋渦狀生長(圖2)。

2.2 裂解液中的蛋白濃度

裂解液中蛋白濃度測(cè)定結(jié)果見表1。

圖1 ADSCs 形態(tài)(×40) 圖2 FBs形態(tài)(×40)
Fig 1 Morphology of ADSCs of mice (×40). Fig 2 Morphology of FBs of mice (×40).

表1 生物素標(biāo)記方案Tab 1 Biotin labeling scheme

2.3 僅ADSCs分泌的細(xì)胞因子/蛋白

FBs裂解液中信號(hào)值≤1的細(xì)胞因子共31種，包括HGF、P-Selectin、Growth Hormone R、Coagulation FactorⅢ/Tissue Factor、GDF-9、Frizzled-1、Eotaxin、Osteoporotegerin、IL-6 R、IL-3 R alpha、MMP-12、FGF R4、TGF-beta 2、MIP-3 alpha、Fit-3 Ligand、Osteopontin、IL-23、Activin RIB/ALK-4、IL-21 R、Frizzled-7、IL-13、TFPI、CXCR4、IGFBP-2、LEPTIN(OB)、PDGF C、TGF-beta RI/ALK-5、TRAIL R2/TNFRSF10B、VE-Cadherin、MIP-1 alpha、VCAM-1等細(xì)胞因子。

2.4 ADSCs分泌多于FBs的細(xì)胞因子

ADSCs分泌多于FBs的細(xì)胞因子共20種，包括MMP-24/MT5-MMP、TIMP-1、SLPI、Tie-2、IL-17F、B7-1/CD80、GDF-3、Endocan、S100A10、PF-4、CCL7/MCP-3/MARC、VEGF、Crossveinless-2、IL-21、LIGHT/TNFSF14、MMP-2、beta-Catenin、FGF-21、IL-4、SDF-1(P<0.05)。

3 討論

ADSCs主要是通過分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其可以分泌VEGF、IGF、HGF、TGF-β1等許多因子成分。這些細(xì)胞因子對(duì)加速創(chuàng)傷[3]和創(chuàng)面的再生、愈合等起到關(guān)鍵作用。具體機(jī)制包括加速成纖維細(xì)胞膠原合成、抗氧化、抗凋亡等生物學(xué)作用。許多學(xué)者證實(shí)ADSCs具有促進(jìn)HDFs增殖、合成膠原蛋白、分泌多種細(xì)胞因子、協(xié)助血管再生、抗氧化等作用。筆者的前期實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)表明，ADSCs裂解液可以明顯改變光老化的成纖維細(xì)胞的增殖能力及生物學(xué)功能的表達(dá)[4-6]。

但ADCSs中到底有哪些細(xì)胞因子成分參與了老化成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用調(diào)控，尤其是與成纖維細(xì)胞比較，兩者分泌的細(xì)胞因子中，哪些成分是有明顯的差異的。這些分泌水平有差異的蛋白因子即有可能是調(diào)控衰老成纖維細(xì)胞的最主要成分，基于這個(gè)推斷，筆者對(duì)小鼠ADSCs裂解液進(jìn)行了蛋白質(zhì)組織學(xué)分析，通過確定差異蛋白，即有可能尋找出具有明顯的生物學(xué)作用的蛋白因子成分。

蛋白芯片的檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于FBs裂解液，ADSCs裂解液中含有更多的細(xì)胞因子，這與許多研究結(jié)果類似。其中，許多細(xì)胞因子僅在ADSCs裂解液中檢測(cè)到，其中包括PDGF C、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等細(xì)胞因子。HGF是存在于急性肝損傷動(dòng)物血漿中的蛋白因子，能刺激肝細(xì)胞DNA合成，且在肝再生過程中起重要作用。HGF不同于再生肝和胚胎肝細(xì)胞中的肝刺激物質(zhì)，其對(duì)許多組織和細(xì)胞的生長、分化起重要調(diào)控作用[7]；而PDGF-C 在成年小鼠中有3個(gè)轉(zhuǎn)錄子(大小分別為1.8、2.9和3.5 kb)，是血小板源性生長因子家族中的一員，是成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及其他間充質(zhì)來源細(xì)胞的強(qiáng)有絲分裂原和化學(xué)驅(qū)動(dòng)劑[10]。PDGF可促進(jìn)皮下血管形成[8]，修復(fù)皮下血液微循環(huán)系統(tǒng)；促進(jìn)膠原蛋白的合成[9]，延緩衰老；另外，其作為一種重要的有絲分裂原，可促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖，淡化皺紋。由此可以推測(cè)，這些ADCSs特異性的蛋白因子都有可能參與老化成纖維細(xì)胞的生物學(xué)作用。

而有一些細(xì)胞因子，如VEGF、FGF-21等在ADSCs裂解液中的含量顯著高于FBs裂解液中含量。其中VEGF(即血管內(nèi)皮生長因子)是最有效的促血管生長因子。而FGF-21(即成纖維細(xì)胞生長因子-21)是屬于FGF基因家族中的一員，是一種重要的保護(hù)糖代謝穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞因子，具有胰島素類似的作用[10]；同時(shí)其也具有調(diào)節(jié)脂代謝，促進(jìn)有絲分裂和導(dǎo)致組織增生的作用，但其是否對(duì)光老化成纖維細(xì)胞具有促進(jìn)分裂的作用，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。這些含量相對(duì)較高的因子對(duì)光老化FBs是否具有生物學(xué)作用，以及作用的途徑和機(jī)制都有待于進(jìn)一步明確。

總之，這些初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了ADSCs裂解液中包含豐富的細(xì)胞因子，而且，某些特異性的因子對(duì)光老化成纖維細(xì)胞可能具有保護(hù)作用，今后的研究將聚焦于這些特異性因子，明確其作用機(jī)制和原理。

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Cytokines and proteomics analysis of mouse adipose-derived stem cells

YANGQing-jian,BIBo,CHENLiang,ZENGJi-ping,YANGPing,ZHOUYi-qun,GUOYu,ZHUJing-jing,ZHUNing-wen,LIUTian-yi.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

LIUTian-yi,Email：tianyiliucn@126.com

Objective To compare the difference of secretion cytokines between adipose-derived stem cells (ADSCs) and fibroblast cells (FBs). Methods ADSCs and FB cultured in vitro, then cytoplasm protein from ADSCs and FB were extracted. Expression level of cytokines was measured by protein chip. Differences between the two different cell extracts were analyzed by using software SPSS. Results Thirty-one kinds of cytokines secreted from ADSCs only, but none from FBs; 20 kinds of cytokines secreted from ADSCs were more than those from FBs. The contents of VEGF, FGF-21 in the ADSCs extracts were significantly more than those in the FBs extracts (P<0.05); HGF, PFGF-C were detected only in the ADSCs extracts. Conclusion The secretion of cytokines between the ADSCs and FBs were obviously different. Compared with FBs, the ADSCs were capable of secreting more kinds of cytokines.

Adipose-derived stem cells; Fibroblasts; Cytokines; Proteomics analysis; Mouse

國家自然科學(xué)基金(81272125；81301642)；國家863計(jì)劃(2014AA020705)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃(XBR2011033)

200040 上海,復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科(楊清建，畢 波，陳 亮，曾繼平，楊 平，周軼群，郭 妤，朱晶晶，劉天一)；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 皮膚科(朱寧文)

楊清建(1987-)，男，山東曹縣人，碩士研究生.

劉天一，200040，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.005

R318

A

1673-7040(2016)02-0079-03

2015-11-24)