蔣增海，徐耀輝*，鄧同煒，陳　益，盧建洲

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

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副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

蔣增海1，2，徐耀輝1，2*，鄧同煒1，2，陳益1，2，盧建洲1，2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

摘要：副豬嗜血桿菌能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等，是影響豬的最重要細(xì)菌之一，目前在所有的主要養(yǎng)豬國家均有存在。為了弄清河南省副豬嗜血桿菌病流行情況，2012年-2015年，從河南不同地區(qū)豬場送檢的疑似病料，進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離和鑒定，共分離到5株細(xì)菌，通過細(xì)菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征鑒定、生化試驗(yàn)、PCR檢測，鑒定為副豬嗜血桿菌，分別命名為A6-fei、C3-xin、C12-xin、D2-fei 和E1-fei。采用紙片擴(kuò)散法，對分離5株副豬嗜血桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其結(jié)果表明所分離的5株副豬嗜血桿菌的藥物敏感性不盡相同，各分離菌株對頭孢噻肟、氟苯尼考星最敏感，對復(fù)方新諾明敏感性最差，其中菌株C3-xin對復(fù)方新諾明、慶大霉素、卡那霉素、青霉素完全耐藥。表明副豬嗜血桿菌病在河南省依然存在，并且不同地區(qū)菌株對常用藥物的敏感性各不相同，應(yīng)當(dāng)引起養(yǎng)豬場重視。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hp)是定植于健康仔豬上呼吸道的一種常在菌，是豬Gl?sser′s disease的病原體[1]。副豬嗜血桿菌通常只感染豬，可以影響2周齡到4月齡的青年豬,主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，常見于5周齡～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)病死率可達(dá)50%[2]。將常規(guī)飼養(yǎng)的豬群混合于嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)的早期斷奶豬群,可能會導(dǎo)致感染和嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)楹笳呷狈︶槍Ω必i嗜血桿菌的免疫力[3-4]。近年來，我國各個地區(qū)均有副豬嗜血桿菌病的報(bào)道[5-7]，說明該病流行依然嚴(yán)重。

副豬嗜血桿菌血清型復(fù)雜多樣，按照Kieletein-rapp-gabriedson(KRG)瓊脂分型方法，至少可將其分為15個血清型，另外20%以上的分離菌株血清型不可定型[8]，這些特點(diǎn)給副豬嗜血桿菌病免疫預(yù)防帶來巨大的挑戰(zhàn)。2012年-2015年，筆者從河南不同地區(qū)豬場采集疑似發(fā)生副豬嗜血桿菌病的病料，進(jìn)行副豬嗜血桿菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)，其目的是了解本地區(qū)副豬嗜血桿菌病流行情況，為該病控制提供參考方案。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料從河南不同地區(qū)發(fā)病豬場，收集疑似副豬嗜血桿菌病的病料。臨床上多表現(xiàn)為體溫升高，咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、關(guān)節(jié)腫大、站立不起、皮膚紫斑等。剖解表現(xiàn)為胸腔、腹腔、心包腔積液，大量纖維素性物質(zhì)滲出，覆蓋于肺、心外膜、腸、肝臟等組織，胸與肺粘連、關(guān)節(jié)腫大、關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液、心包膜增厚“絨毛心”(圖1)。

1.1.2培養(yǎng)基巧克力瓊脂平板、綿羊鮮血瓊脂平板購自鄭州博賽生物有限公司;普通營養(yǎng)瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;TSA(胰蛋白大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白大豆肉湯)購自美國BD(Becton,Dickinson and Company)公司;TSA平板、TSB肉湯配制時(shí)，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(縮寫NAD，終濃度為10 mg/1 000 mL)和犢牛血清(終濃度50 mL/1 000 mL);巧克力瓊脂培養(yǎng)基，每個平板添加NAD 0.1 mg 。

1.1.3引 物 參考文獻(xiàn)[9-10]，根據(jù)副豬嗜血桿菌16 S rRNA(M75065)序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增的預(yù)期產(chǎn)物為822 bp大小的片段。上游引物：5′-GGC TTC GTC ACC CTC TGT -3′； 下游引物：5′-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT -3′。

1.1.4主要試劑犢牛血清購自杭州四季青生物有限公司;N A D 購自Roche公司;使用前均需過濾除菌;微量生化試管、氧化酶試紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;rTaq酶、dNTPs 、10 ×PCR buffer(Mg2+plus)、DNA Marker DL 2 000 等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1病原菌分離、培養(yǎng)及純化每頭疑似發(fā)病豬，均無菌采集肺、心臟、關(guān)節(jié)等病料，750 mL/L酒精棉球擦拭并引火自燃，反復(fù)2～3次，除去表面雜菌，同時(shí)火焰燃燒消毒剪刀、鑷子，剪去外表面的組織，取深部組織，或者滅菌棉簽采集心血、關(guān)節(jié)液，分別接種TSA，37℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h。挑取圓形、光滑濕潤、無色透明、直徑0.5 mm～2 mm 的可疑菌落，再次接種TSA、巧克力瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板，反復(fù)2次～3次進(jìn)行純化，直到無雜菌為止。

1.2.2染色、鏡檢挑取上述純培養(yǎng)的圓形、光滑、無色透明可疑菌落涂片, 革蘭染色后，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3衛(wèi)星生長現(xiàn)象用接種環(huán)分別挑取上述可疑菌的單菌落, 水平劃線于綿羊鮮血瓊脂平板上, 再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線, 37℃ 培養(yǎng)24 h～48 h, 看是否有“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象。

1.2.4PCR檢測挑取純培養(yǎng)的2個單菌落洗脫于含200 μL去離子無菌水中，渦旋后，沸水浴10 min，凍融1次后，12 000 r/min 離心2 min～3 min，取上清液作DNA模板。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)蔡旭旺博士論文[10]。反應(yīng)體系(50 μL)：10倍緩沖液混合液5 μL，dNTPs 1.0 μL，1.5 μmol/L上游引物1.5 μL，1.5 μmol/L 下游引物1.5 μL, rTaq酶 0.5 μL，滅菌雙蒸水30.5 μL，模板10 μL。反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 50 s，59℃ 50 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min，PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5生化試驗(yàn)將呈現(xiàn)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象、PCR檢測陽性菌落的可疑菌落，純培養(yǎng)后，接種相應(yīng)的生化鑒定管，同時(shí)每支生化鑒定管中加入5 μL 1 mg/mL濃度的NAD，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.2.6藥敏試驗(yàn)將分離純化的副豬嗜血桿菌，接種TSA培養(yǎng)24 h～48 h，使用TSB洗脫，渦旋后，稀釋為0.5麥?zhǔn)蠝啙岫?，棉簽均勻涂抹于TSA平板，然后貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈。

2結(jié)果

2.1分離、培養(yǎng)特性

在加有NAD、犢牛血清的TSA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h～48 h，可見圓形、邊緣光滑、無色透明、直徑約為0.5 mm～2 mm菌落(圖2)。在加有NAD巧克力瓊脂平板生長比無NAD巧克力瓊脂平板生長更好。普通營養(yǎng)瓊脂無生長。共分離到5株疑似副豬嗜血桿菌。

A.心包炎，心表面大量纖維素性物質(zhì)；B.絨毛心，肺臟覆蓋大量淡黃色纖維素性物

A.Pericarditis featured by fibrinous exudate on epicardium；B.Pericarditis villosa and a large amount of fibrinous exudate on lung

圖1副豬嗜血桿菌病病理特征

Fig.1Pathological characteristics caused byHaemophilusparasuis

圖2TSA副豬嗜血桿菌48 h ，生長無色透明、

圓形、光滑菌落

Fig.2Colorless and transparent,round and smooth-edge colonies

ofHaemophilusparasuisisolates cultured in TSA for 48 hours

2.2菌株的分離信息背景

5株疑似副豬嗜血桿菌均從肺臟或者心血分離到，分別命名為A6-fei、C3-xin、 C12-xin、D2-fei、 E1-fei。各分離菌株來自不同豬場，其位置分別是焦作(2014.11.7)、駐馬店(2014.12.14)、中牟(2014.12.27)、新鄉(xiāng)(2015.1.10)和開封(2015.4.20)5個地區(qū)。分離到菌株的豬群，全部為發(fā)病保育仔豬，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，呼吸困難，咳嗽，消瘦，關(guān)節(jié)腫大，采食下降，有的是剛斷奶不久仔豬，腹瀉，咳嗽，病變主要為肺臟纖維素性物質(zhì)覆蓋，胸腔積液，心包積液，心包粘連，有的呈“絨毛心”，發(fā)病率為10%～20%，病死率20%～30%，病程長。

2.3染色、鏡檢

革蘭染色后，顯微鏡下觀察，見革蘭陰性桿菌，具有多種形態(tài)，從短桿狀、細(xì)長桿狀到長絲狀不等，多數(shù)細(xì)菌形態(tài)為略微彎曲桿狀(圖3)。

2.4衛(wèi)星生長現(xiàn)象

“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象試驗(yàn)結(jié)果表明離葡萄球菌菌苔越近長勢越好，越遠(yuǎn)菌落小甚至未出現(xiàn)菌落，無溶血現(xiàn)象(圖4)。

2.5PCR檢測結(jié)果

挑取可疑菌落，進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增片段處于750 bp～1 000 bp之間，與預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段822 bp大小一致(圖5)。

A.副豬嗜血桿菌培養(yǎng)24細(xì)菌形態(tài)；B.副豬嗜血桿菌培養(yǎng)48 h細(xì)菌形態(tài)

A.Morphology ofHaemophilusparasuisisolates cultured for 24 hours；B.Morphology ofHaemophilusparasuisisolates cultured for 48 hours

圖3副豬嗜血桿菌菌體形態(tài)

Fig.3Morphology ofHaemophilusparasuisisolates

圖4衛(wèi)星生長現(xiàn)象

Fig.4The satellite growth phenomenon

2.6生化試驗(yàn)結(jié)果

分離可疑菌株脲酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽性，氧化酶試驗(yàn)陰性，硫化氫試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、半乳糖和D-核糖，不發(fā)酵阿拉伯糖、乳糖、甘露醇和木糖。均符合副豬嗜血桿菌的生化特征。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對照；2～6.分別為分離菌株A6-fei、C3-xin、C12-xin、D2-fei 和E1-fei擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-6.PCR amplified products from the isolates HPsA6-fei,HPsC3-xin,HPsC12-xin，HPsD2-fei，HPsE1-fei respectively

圖5PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.5Agarose gel electrophoresis of PCR products from the isolates

2.7藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將分離5株副豬嗜血桿菌分別做藥敏試驗(yàn)(表1)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明所分離的5株副豬嗜血桿菌的藥物敏感性不盡相同，各分離菌株對頭孢噻肟、氟苯尼考抑菌圈最大，而對復(fù)方新諾明抑菌圈最小，其中菌株C3-xin對復(fù)方新諾明、慶大霉素、卡那霉素、青霉素抑菌圈為零，屬于完全耐藥。

表1　分離5株副豬嗜血桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3討論

副豬嗜血桿菌屬于巴氏桿菌科,革蘭陰性細(xì)菌,通常被認(rèn)為是存在于健康豬群上呼吸道的共生細(xì)菌,但同時(shí)也是引起Glasser′s病的病原菌,以多發(fā)性獎膜炎,關(guān)節(jié)炎,腦膜炎為主要特征[11]。本研究從河南不同地區(qū)豬場，采集疑似副豬嗜血桿菌病肺臟、心血、關(guān)節(jié)等病料，分別接種、培養(yǎng)，分離純化到5株副豬嗜血桿菌，表明該病在河南不同地區(qū)的存在，因此，對該病的防控應(yīng)引起重視。

副豬嗜血桿菌是一種條件苛性細(xì)菌，比較嬌嫩，難以分離與培養(yǎng)，病料采集部位是關(guān)鍵，本研究表明5株副豬嗜血桿菌從肺臟和心血分離到，表明最容易分離到副豬嗜血桿菌病料是肺臟和心血等，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。由于副豬嗜血桿菌為上呼吸道常在菌，同時(shí)存在許多不致病的血清型。因此,在扁桃體等上呼吸道中分離到該菌不一定代表出現(xiàn)了全身性感染。從具有呼吸道臨床癥狀的豬的內(nèi)臟器官中進(jìn)行副豬嗜血桿菌的分離鑒定是可行的方案[13-14]。本研究由于從肺臟和心血分離到5株副豬嗜血桿菌，表明具有一定臨床意義，但是如果確定分離5株副豬嗜血桿菌的致病性，還需要進(jìn)一步做動物攻毒試驗(yàn)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,分離5株副豬嗜血桿菌對各種藥物的敏感性不盡相同，由于頭孢噻肟屬于人用藥物，目前副豬嗜血桿菌藥敏試驗(yàn)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和解釋折點(diǎn)，參照文獻(xiàn)[15]中副流感嗜血桿菌和傳染性胸膜肺炎放線桿菌判斷標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮，臨床上推薦氟苯尼考、氧氟沙星、恩諾沙星、氨芐西林、強(qiáng)力霉素作為副豬嗜血桿菌病的治療用藥。但是，在條件允許下，最佳措施是在副豬嗜血桿菌病的發(fā)病初期，沒有使用藥物治療前，采集病料、分離病菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選敏感藥物，設(shè)計(jì)治療方案。

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Isolation，Identification and Drug Sensitivity Test ofHaemophilusparasuis

JIANG Zeng-hai1，2,XU Yao-hui1，2,DENG Tong-wei1，2,CHEN Yi1，2,LU Jian-zhou1，2

(1.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy，CollegeofVeterinaryMedicine，Zhengzhou,Henan,450046,China；2.HenanEngineeringandTechnologyResearchCenterofVeterinaryBiotechnology,Zhengzhou,Henan,450046,China)

Abstract:Haemophilusparasuis, one of the most important bacteria affecting pigs, is present in all major swine-rearing countries, causing clinical signs such as polyserositis, polyarthritis, meningitis, and so on. In order to understand the prevalence ofHaemophilusparasuisinfection in Henan province, we performed the isolation ofHaemophilusparasuisfrom a lot of samples collected through pig farms in different regions of Henan province between 2012 and 2015, and finally five suspected strains of germs were isolated. The five isolates were identified asHaemophilusparasuison the basis of morphological characteristics, culture characteristics, biochemical reaction characteristics and the result of a PCR test aimed to detectHaemophilusparasuis. The five isolates were respectively named asH.parasuisA6-fei,H.parasuisC3-xin,H.parasuisC12-xin,H.parasuisD2-fei andH.parasuisE1-fei.Drug sensitivity tests of the five isolates ofHaemophilusparasuisbased on disk diffusion indicated that drug sensitivity of the five isolates were different, all were highest sensitive to cefotaxime and florfenicol, with lowest sensitivity to cotrimoxazole and penicillin, and the strain C3-xin was completely resistant to cotrimoxazole , gentamicin, kanamycin and penicillin.In conclusion ,we suggest thatHaemophilusparasuisis still prevalent in Henan province, and its sensitivity to drugs is different in different areas.Therefore, pig producers should pay attention to prevent and controlHaemophilusparasuisinfection.

Key words:isolation and identification;Haemophilusparasuis; drug sensitivity test

收稿日期：2015-11-04

基金項(xiàng)目：河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(122102110131)

作者簡介：蔣增海(1976-)，男，四川簡陽人，講師，博士，主要從事豬病原微生物研究。 *通訊作者

中圖分類號:S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0124-05