宋躍君，徐　玉，張遠(yuǎn)洲，劉　洪，張照宇，唐小明，林　源，王衛(wèi)國，魯杏華，邱立新， 何世成，王昌建*

(1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；3.張家界市動物疫病預(yù)防控制中心，湖南張家界 427100；4.慈利縣畜牧水產(chǎn)局，湖南慈利 427200)

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小反芻獸疫疫苗臨床免疫效果試驗

宋躍君1，徐玉2，張遠(yuǎn)洲3，劉洪4，張照宇4，唐小明1，林源1，王衛(wèi)國1，魯杏華1，邱立新1， 何世成1，王昌建1*

(1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；3.張家界市動物疫病預(yù)防控制中心，湖南張家界 427100；4.慈利縣畜牧水產(chǎn)局，湖南慈利 427200)

摘要：為評估小反芻獸疫弱毒活疫苗(75/1 株)的臨床免疫效果，通過免疫試驗、免疫場的跟蹤檢測以及熒光RT-PCR檢測方法，對疫苗免疫安全性、免疫抗體持續(xù)期、抗體效價消長情況進(jìn)行了臨床免疫測試和評估。結(jié)果顯示，疫苗免疫安全性良好，免疫后14 d可以檢測到疫苗核酸，免疫后7 d開始產(chǎn)生特異性抗體，抗體持續(xù)時間達(dá)12個月以上。研究表明臨床用小反芻獸疫疫苗具有良好的免疫原性，可產(chǎn)生良好的臨床免疫效果。

關(guān)鍵詞：小反芻獸疫疫苗；免疫效果；抗體；病原核酸檢測

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)又稱小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎綜合征等，是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbolivirus)的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種烈性、高度接觸性傳染病，主要感染小反芻獸，山羊和綿羊高度易感，野生動物也偶有感染。該病是我國的一類動物疫病，OIE規(guī)定疫情必須上報[1-2]。1942年該病首次報道發(fā)現(xiàn)于非洲西部的象牙海岸，隨后10多年幾乎傳遍了從撒哈拉沙漠到赤道的所有國家，由西非、中非和東非向東擴(kuò)散，目前已傳播到西亞和南亞地區(qū)，且有上升趨勢。截至2003 年8 月，我國周邊國家包括老撾、尼泊爾、印度、孟加拉國、俄羅斯、巴基斯坦和緬甸等國均暴發(fā)過大規(guī)模小反芻獸疫疫情。2007年該病首次傳入我國西藏自治區(qū)日土縣，證實為境外輸入疫情[3]。2013年再次傳入，2014年在我國大范圍暴發(fā)，自首次發(fā)生以來一直呈擴(kuò)大趨勢，成為了嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)安全的重大跨國動物疫病之一[4]。目前，肯尼亞、索馬里等非洲國家，印度、巴基斯坦等亞洲國家仍遭受小反芻獸疫帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。2014 年我國農(nóng)業(yè)部共發(fā)布小反芻獸疫疫情260 起，涉及21 個省份，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的損失[6]。

為準(zhǔn)確評估小反芻獸疫疫苗臨床免疫效果，結(jié)合臨床免疫試驗和免疫場的回顧性檢測，研究了小反芻獸疫活疫苗的臨床免疫效果，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1疫苗小反芻獸疫活疫苗，新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)(批號：2015001-2)。試驗用疫苗取自湖南省慈利縣疫苗儲備庫。

1.1.2試驗羊場臨床免疫試驗羊場為張家界市慈利縣巖洛村李氏養(yǎng)羊場，存欄羊約120頭，該場位于山間，天然防疫屏障良好，飼養(yǎng)的本地山羊為山地放養(yǎng)，場主飼養(yǎng)經(jīng)驗豐富，防疫、管理意識較強(qiáng)；免疫調(diào)查試驗樣品來源于常德、張家界等地區(qū)的免疫場。

1.1.3檢測試劑小反芻獸疫抗體檢測試劑盒(ID Screen?PPR Competition，批號：757)購自法國ID-VET；小反芻獸疫熒光RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司(批號：20141020)。

1.2方法

1.2.1免疫試驗對25頭2～3月齡試驗羊進(jìn)行疫苗免疫，同時選5頭2～3月齡羊作為空白對照組，試驗組用獸用耳標(biāo)和塑料小標(biāo)簽系頸部進(jìn)行雙重標(biāo)記。免疫前，逐頭采集試驗組和空白對照組羊的血清和眼拭子、鼻拭子、肛門拭子等樣品；采樣后，試驗組每頭羊頸后皮下注射試驗疫苗1頭份，空白對照組不免疫。免疫接種后連續(xù)7 d，對試驗動物進(jìn)行臨床觀察記錄；同時于免疫接種后1、3、5、7、14、21、28、56、84、112、145 d進(jìn)行采樣，試驗組與空白對照組分別全部采集血清和拭子(拭子樣品采集至免疫后28 d)，每頭羊的眼拭子、鼻拭子、肛門拭子對應(yīng)分3管保存。

1.2.2疫苗安全性試驗對5頭6月齡未免疫山羊進(jìn)行10頭份PPRV疫苗免疫接種，免疫接種后連續(xù)7 d，觀察記錄試驗動物的免疫反應(yīng)。

1.2.3免疫抗體持續(xù)期評估篩選免疫操作技術(shù)規(guī)范、免疫記錄清晰的規(guī)模羊場75個為免疫場，每場采集免疫羊血清10份～20份；其中，在36個免疫場內(nèi)采集到免疫后6個月的羊血清465份，在39個免疫場采集到免疫后12個月的羊血清435份。檢測PPRV抗體，結(jié)合免疫試驗結(jié)果，評估疫苗免疫后抗體的持續(xù)時間。

1.2.4實驗室檢測用法國ID-VET生產(chǎn)的ID Screen?PPR Competition 小反芻獸疫抗體檢測試劑盒檢測血清中的PPRV抗體(競爭ELISA法,S/N值≤50%為陽性)，用北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司小反芻獸疫熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測血清、拭子中的PPRV核酸，按說明書進(jìn)行操作。

2結(jié)果

2.1免疫副反應(yīng)結(jié)果

1頭份免疫試驗羊、10頭份免疫試驗羊免疫接種后均未見免疫副反應(yīng)，連續(xù)觀察7 d，試驗羊精神狀態(tài)良好，食欲及生長發(fā)育正常。

2.2免疫試驗血清抗體檢測結(jié)果

免疫接種后，抗體消長曲線明顯，免疫接種后第7天產(chǎn)生抗體，群體抗體合格率迅速上升至92%，免疫接種后第14天群體陽性率達(dá)100%，未免疫組抗體陽性率持續(xù)為0；各檢測點(diǎn)抗體效價(S/N%值)群體均一性好，變異系數(shù)低，平均值為0.21。免疫前后羊血清小反芻獸疫疫苗抗體效價消長曲線見圖1，群體陽性率結(jié)果見圖2。

2.3試驗動物病原核酸檢測結(jié)果

熒光RT-PCR操作簡便，敏感性比普通RT-PCR高，逐漸受到青睞[7]。對免疫接種前和免疫接種后1、3、5、7、14、21、28 d的鼻、眼、肛門拭子以及血清樣品進(jìn)行PPRV核酸檢測。結(jié)果顯示，免疫接種后14 d的羊群中檢測出1份羊肛門拭子樣品PRRV核酸陽性，陽性率為4%(1/25)，其余樣品均為陰性，試驗羊免疫接種前后PPRV核酸檢測結(jié)果見表1。

2.4免疫抗體持續(xù)期評估

36個免疫場收集的465份免疫后6個月的血清抗體陽性率為83.2%，39個免疫場收集的435份免疫后12個月的血清抗體陽性率為90.3%(表2)；結(jié)合免疫試驗的結(jié)果，PPRV疫苗免疫后，第7天可產(chǎn)生群體保護(hù)，抗體持續(xù)期至少可維持12個月。

圖1　小反芻獸疫疫苗免疫試驗抗體效價消長曲線圖

圖2　小反芻獸疫疫苗免疫試驗抗體陽性率曲線圖

3討論

本次試驗，所有免疫動物免疫接種后均未出現(xiàn)明顯的免疫副反應(yīng)，表明試驗疫苗具有良好的臨床免疫安全性。 免疫試驗結(jié)果顯示，羊群免疫接種疫苗后，前5 d未檢測到抗體陽性，第7天抗體陽性率迅速上升至92%，免疫接種后14 d抗體陽性率可達(dá)100%，免疫組平均變異系數(shù)為0.21，抗體產(chǎn)生迅速，均一性高，表明試驗疫苗具有良好的免疫原性，試驗結(jié)果優(yōu)于何利昆等人的研究報道[8]。

為更好的評估免疫后抗體的持續(xù)期，本試驗采用臨床免疫和免疫場監(jiān)測相結(jié)合的方式評估免疫抗體持續(xù)期，結(jié)果顯示，小反芻獸疫疫苗抗體持續(xù)期在12個月以上，這與印春生、薛青紅等人的評估結(jié)果一致[2,9]。

表1　PPRV核酸學(xué)檢測結(jié)果

注：陽性數(shù)/樣品數(shù)。

Note:Positive numbers/samples.

表2　免疫場免疫持續(xù)期檢測結(jié)果明細(xì)表

弱毒疫苗Nigeria75/1是OIE規(guī)定的唯一允許使用的PPRV疫苗,在我國，新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司于2007年10月份開始批量生產(chǎn)小反芻獸疫弱毒活疫苗(75/1 株)并用于全國PPR疫情防控[10]。由于生產(chǎn)廠家唯一，臨床流通疫苗的質(zhì)量是否持續(xù)符合防疫要求是人們迫切關(guān)注的問題，本研究結(jié)果表明，隨機(jī)取自縣級疫苗儲備庫中的疫苗免疫效果良好。

參考文獻(xiàn)：

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Clinical Immune Effect of Peste Des Petits Ruminants Vaccine

SONG Yue-jun1,XU Yu2,ZHANG Yuan-zhou3,LIU Hong4,ZHANG Zhao-yu4,TANG Xiao-ming1,LIN Yuan1,WANG Wei-guo1,LU Xing-hua1,QIU Li-xin1,HE Shi-cheng1,WANG Chang-jian1

(1.HunanCenterforAnimalDiseasePreventionandControl,Changsha,Hunan,410014,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan,410128,China;3.ZhangjiajieCenterforAnimalDiseasePreventionandControl,Zhangjiajie,Hunan,427100,China;4.CiliCountyAnimalHusbandryandAquacultureAdministration,Cili,Hunan,427200,China)

Abstract:In order to assess the clinical immune effect of peste des petits ruminants attenuated live vaccine (75/1),the vaccines immune safety,immune antibody duration,growth and decline of the antibody titers were tested and evaluated by immune experiments,immune farm tracking detection and fluorescent RT-PCR method.The results showed that the vaccine nucleic acids can be detected 14 days after immunization, specific antibodies can be detected 7 days after immunization,and the duration of the antibody exceeds more than 12 months.Research showed that the peste des petits ruminants vaccine for clinical use has good immunogenicity,can produce good clinical immune effect.

Key words:Peste des petits ruminants vaccine；immune effect;antibody；pathogen detection

收稿日期：2015-12-12

作者簡介：宋躍君(1961-)女，湖南瀏陽人，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控工作。*通訊作者

中圖分類號:S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0077-03