尹珺伊，候美如，王　巖，劉　宇，周慶民，秦平偉，史同瑞

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

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產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌分離株的生物學(xué)特性研究

尹珺伊，候美如，王巖，劉宇，周慶民，秦平偉，史同瑞*

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006)

摘要：對(duì)發(fā)酵黃芪樣品中分離的1株產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株在10℃～60℃環(huán)境均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為35℃～40℃。pH5.0～8.0培養(yǎng)基均適宜菌株生長(zhǎng)，其中最適pH為6.0。在37℃環(huán)境200 r/min振蕩培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線在0～4 h為延遲期，4 h～12 h為對(duì)數(shù)期，12 h～24 h為穩(wěn)定期，24 h以后為衰亡期。細(xì)菌37℃培養(yǎng)32 h開始產(chǎn)生芽胞，在培養(yǎng)72 h時(shí)芽胞形成率達(dá)到80.67%。菌株對(duì)多數(shù)抗菌藥物敏感，且安全性良好。該菌株適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)條件較為寬松，這為其開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)纖維素酶；解淀粉芽胞桿菌；生物學(xué)特性

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種與枯草芽胞桿菌親緣性很高的細(xì)菌，自然界中分布廣泛[1]。解淀粉芽胞桿菌易生長(zhǎng)，抗逆性強(qiáng)，在其生長(zhǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)和多種酶類，因此該菌不僅可用于動(dòng)物疾病的防治，而且還能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能，是一種較為理想的微生態(tài)菌[2]。近年來(lái)，隨著解淀粉芽胞桿菌研究的深入，解淀粉芽胞桿菌的應(yīng)用前景更加廣闊。最近，作者從發(fā)酵黃芪的樣品中分離鑒定出1株產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽胞桿菌，并對(duì)其纖維素酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。本文研究了該菌的生物學(xué)特性，旨在為其發(fā)酵黃芪工藝優(yōu)化及其制劑的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽胞桿菌菌株由本研究室分離保存；健康小鼠，體重19 g～21 g，雌雄兼有，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)。

1.1.2試劑與儀器微量生化反應(yīng)鑒定管、藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；UV-5900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海元析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1形態(tài)觀察及生化試驗(yàn)取在37℃環(huán)境培養(yǎng)16、18、24、48和72 h的解淀粉芽胞桿菌菌液，涂片，革蘭染色，鏡檢菌體形態(tài)。取菌種接種營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，分別置于有氧和厭氧條件下在37℃環(huán)境培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，觀察菌株培養(yǎng)特性及嗜氧性。取培養(yǎng)18 h～20 h菌液接種生化管置37℃環(huán)境培養(yǎng)，測(cè)定細(xì)菌生化特性。

1.2.2適宜生長(zhǎng)溫度測(cè)定取解淀粉芽胞桿菌菌株18 h～20 h培養(yǎng)液，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL。以1%接種量接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別置溫度為10、20、30、35、40、45、50、60、70℃環(huán)境以200 r/min振蕩培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)方法[3]，在培養(yǎng)18、24、42 h取樣，以無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定各培養(yǎng)溫度下菌株培養(yǎng)液的OD值。以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制菌液含菌量柱形圖，比較細(xì)菌生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3適宜生長(zhǎng)酸堿度測(cè)定取1.2.2調(diào)整菌液，以1%接種量接種pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9的營(yíng)養(yǎng)肉湯，置37℃以200 r/min振蕩培養(yǎng),18、24、42 h取樣，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定各pH條件下菌株培養(yǎng)液的OD值。以無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯作空白對(duì)照，以pH為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制菌液含菌量柱形圖。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定取1.2.2調(diào)整菌液，以1%接種量接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，置37℃以200 r/min振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、30、36、42、48、56、72、80、96 h取樣，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌株培養(yǎng)液的OD值。以無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯作空白對(duì)照，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5芽胞形成情況測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[4]，取培養(yǎng)16、20、24、48、64、72 h的菌液，作10倍連續(xù)稀釋。用無(wú)菌移液管分別取108、109、1010共3個(gè)稀釋度的稀釋菌液0.1 mL，涂布接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)。剩余稀釋菌液置80℃水浴處理10 min～15 min，無(wú)菌吸取0.1 mL處理菌液，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，計(jì)數(shù)芽胞形成率。芽胞形成率(%)=(形成芽胞的菌數(shù)/總菌數(shù))×100%。

1.2.6藥敏試驗(yàn)應(yīng)用KB法測(cè)定菌株的藥物敏感性。取菌株接種MH肉湯，37℃培養(yǎng)16 h～20 h，用MH肉湯調(diào)整菌液濃度至0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度，然后接種MH瓊脂平板，貼上藥敏片，置37℃培養(yǎng)16 h～18 h，測(cè)定抑菌圈直徑，依據(jù)藥敏片判定標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌的藥物敏感性。

1.2.7安全性試驗(yàn)選用健康小鼠20只，隨機(jī)均分4組，雌雄各半。Ⅰ組灌服菌液，Ⅱ組腹腔注射菌液，Ⅲ組灌服生理鹽水，Ⅳ組腹腔注射生理鹽水。灌服劑量為0.5 mL/只，2次/d，連續(xù)灌服7 d。注射劑量為一次性注射0.3 mL/只。試驗(yàn)菌液為菌株18 h～24 h肉湯培養(yǎng)物，菌液濃度約為36×108CFU/mL。每天觀察記錄小鼠臨床表現(xiàn)，死亡鼠剖檢，觀察2周后處死全部存活小鼠，剖檢內(nèi)臟器官有無(wú)異常變化。

2結(jié)果

2.1菌株形態(tài)及生化特性

菌株為革蘭陽(yáng)性大桿菌，兩端鈍圓，多單在。老齡菌變長(zhǎng)，多呈短鏈狀排列。細(xì)菌形成中生或次端生芽胞，芽胞橢圓形，芽胞直徑不大于菌體(圖1)。

圖1　菌株形態(tài)(1 000×)

菌株為兼性厭氧菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)24 h，形成灰白色、干燥、不透明的大菌落，菌落表面粗糙，有褶皺，邊緣不規(guī)則，有擴(kuò)散。營(yíng)養(yǎng)肉湯靜置培養(yǎng)24 h，肉湯澄清，不產(chǎn)生沉淀，肉湯表面形成灰白色菌膜。

菌株分解葡萄糖、蔗糖，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水楊苷，水解七葉苷，H2S、VP、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶、枸櫞酸鹽、甲基紅試驗(yàn)陰性。

2.2溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株在環(huán)境溫度10℃～60℃均能生長(zhǎng)，其中適宜生長(zhǎng)溫度為30℃～40℃，最適生長(zhǎng)溫度為35℃～40℃。在10℃～40℃范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的升高菌株培養(yǎng)液的OD值逐漸增大，至40℃達(dá)到峰值，但35℃與40℃菌液OD值差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)培養(yǎng)溫度大于40℃時(shí)，菌株培養(yǎng)液的OD值逐漸降低，當(dāng)培養(yǎng)溫度升至60℃時(shí)，菌株培養(yǎng)液的OD值最低(圖2)。

圖2　溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

2.3酸堿度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH5.0～8.0的培養(yǎng)基均適宜菌株生長(zhǎng)，其中最適pH為6.0。培養(yǎng)基pH為2～4時(shí)，菌株培養(yǎng)液的OD值較小，培養(yǎng)基不適宜菌株生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基pH升至5時(shí)，菌液OD值陡然上升。培養(yǎng)基pH升至6時(shí)，菌株培養(yǎng)液的OD值達(dá)到峰值。培養(yǎng)基pH升至9時(shí)，菌液OD值降為0(圖3)。

圖3　pH對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

2.4菌株生長(zhǎng)曲線及芽胞形成情況

菌株在37℃環(huán)境200 r/min振蕩培養(yǎng)，其生長(zhǎng)曲線為：0～4 h為生長(zhǎng)延遲期，4 h～12 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h～24 h為穩(wěn)定期，24 h以后為衰亡期(圖4)。細(xì)菌37℃培養(yǎng)32 h開始產(chǎn)生芽胞，且芽胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，在培養(yǎng)72 h時(shí)芽胞形成率達(dá)到80.67%(圖5)。

圖4　菌株生長(zhǎng)曲線

圖5　菌株芽胞形成情況

2.5菌株藥物敏感性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在測(cè)定的14種常用藥物中，除林可霉素耐藥外，對(duì)其他13種藥物均敏感,見(jiàn)表1。

表1　藥敏試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

注：“R”耐藥；“I”中介；“S”敏感。

Note："R"resistance;"I"intermedium；"S"sensitive.

2.6菌株安全性

試驗(yàn)鼠觀察2周均健活，臨床未見(jiàn)異常癥狀。對(duì)小鼠進(jìn)行剖檢，組織臟器未見(jiàn)病理變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株安全性良好。

3討論

本試驗(yàn)解淀粉芽胞桿菌菌株僅發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，對(duì)多數(shù)糖和醇均不發(fā)酵。參照文獻(xiàn)[5]模式菌株的生化特性，分離菌株具有與解淀粉芽胞桿菌模式菌相近的生化特性。這與劉亞楠等[6]、朱芝秀等[7]報(bào)道相近，而與陳成等[8]、王德培等[9]和曹海鵬等[10]報(bào)道存在較大差異。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株對(duì)多數(shù)抗生素均高度敏感，因此在該菌株發(fā)酵與應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)避免與抗菌藥物的混合使用。

本試驗(yàn)菌株在環(huán)境溫度10℃～60℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，其中適宜生長(zhǎng)溫度為30℃～40℃，最適生長(zhǎng)溫度為35℃～40℃。這與一些學(xué)者報(bào)道的適宜生長(zhǎng)溫度為28℃～38℃基本一致[3,10-13]。試驗(yàn)菌株在pH5.0～8.0環(huán)境適宜生長(zhǎng)，較適宜pH為6.0，這與車曉曦等[11]報(bào)道一致，但低于戴秀華等[3]、曹海鵬等[10]、孫鎮(zhèn)平等[12]等報(bào)道的適宜pH7.0～7.2。

試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)延遲期為培養(yǎng)0～4 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為4 h～12 h，穩(wěn)定期為12 h～24 h。試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)曲線與權(quán)春善等[11]、單哲等[13]報(bào)道基本一致。但與戴秀華等[3]、曹海鵬等[10]報(bào)道有一定差異。試驗(yàn)菌株在培養(yǎng)32 h后開始產(chǎn)芽胞，且芽胞數(shù)量隨時(shí)間增加，在培養(yǎng)72 h時(shí)芽胞含量達(dá)到80.67%，芽胞形成時(shí)間與戴秀華等[3]報(bào)道基本一致，但72 h時(shí)芽胞形成率低于其報(bào)道的95%。細(xì)菌的生長(zhǎng)與培養(yǎng)條件有關(guān)，而芽胞形成也受碳源、氮源、金屬離子濃度，以及培養(yǎng)溫度和溶氧等因素的影響，因此，本試驗(yàn)采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、搖床培養(yǎng)等條件可能是造成與其他學(xué)者報(bào)道結(jié)果不一致的原因。

試驗(yàn)菌株在pH5.0～8.0、環(huán)境溫度30℃～40℃范圍內(nèi)均能較好生長(zhǎng)，且在培養(yǎng)32 h后開始產(chǎn)生芽胞，說(shuō)明該菌適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)條件較為寬松，這為該菌的發(fā)酵和利用提供了便利。黃芪具有保健抗病及提高生產(chǎn)性能作用[14]，發(fā)酵黃芪較黃芪微粉更具優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)也為解淀粉芽胞桿菌分離菌株發(fā)酵黃芪制劑的開發(fā)應(yīng)用奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

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Study on Biological Characteristics of Cellulase-producingBacillusamyloliquefaciens

YIN Jun-yi,HOU Mei-ru，WANG Yan，LIU Yu，ZHOU Qing-ming，QIN Ping-wei，SHI Tong-rui

(HeilongjiangInstituteofVeterinaryMedicine，Qiqihaer，Heilongjiang，161006，China)

Abstract:The biological characteristics of cellulase-producingBacillusamyloliquefaciensisolated from fermentedAstragalussamples were tested in this study. The results showed that the strain could grow at the temperature of 10℃-60℃, and the optimum growth temperature was 35℃-40℃. The strains were able to grow well at a pH range of 5.0-8.0， and the optimum pH was 6.0. Under the condition of shaking culture at 37℃ in the speed of 200 r/min, the growth curve revealed that 0-4 h was lag phase, 4 h-12 h was logarithmic phase, 12 h-24 h was stationary phase, decline phase started after 24 h. It began to form spore after culture for 32 h, and the sporulation rate could reach 80.67% after 72 h. This strain is sensitive to most of antimicrobial drugs, and has good security. The well-adapted character and its loose growth conditions provided basis for its further development and application.

Key words:cellulase;Bacillusamyloliquefaciens; biological characteristics

收稿日期：2015-12-05

基金項(xiàng)目：黑龍江科技計(jì)劃項(xiàng)目(GC13B404)

作者簡(jiǎn)介：尹珺伊(1987-)，女，黑龍江齊齊哈爾人，實(shí)習(xí)研究員，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S852.616

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0045-04