劉順磊，何延華，王熙楚，鄭婷婷，孔科委，黃　新，韓猛立，周　霞*，鐘發(fā)剛*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000)

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新疆石河子規(guī)模化牛場(chǎng)多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

劉順磊1,2，何延華2，王熙楚1，鄭婷婷1，孔科委1，黃新2，韓猛立2，周霞1*，鐘發(fā)剛2*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000)

摘要：為了確定石河子地區(qū)某規(guī)?；?chǎng)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、病牛消瘦甚至死亡的病因，本研究以病牛病變組織為研究對(duì)象，采用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定和細(xì)菌16 S rRNA序列分析來(lái)鑒定菌種，以及多殺性巴氏桿菌種特異性基因Kmt-1和各個(gè)莢膜血清型特異性基因(hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD)PCR擴(kuò)增來(lái)確定細(xì)菌的血清型，同時(shí)應(yīng)用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)和小鼠感染試驗(yàn)。結(jié)果表明，從病變的肺組織中分離到1株菌落為灰白色、露珠狀、不溶血，染色為革蘭陰性球桿狀細(xì)菌，生化鑒定結(jié)果符合巴氏桿菌特征，同時(shí)16 S rRNA序列分析與NCBI上已公布的多殺性巴氏桿菌16 S rRNA序列同源性在99%以上；對(duì)多殺性巴氏桿菌特異性基因Kmt-1以及各血清型特異性基因PCR擴(kuò)增只擴(kuò)增到Kmt-1和hyaD-hyaC特異性基因片段；分離菌株對(duì)鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素耐藥，對(duì)其他30種藥物敏感，同時(shí)感染小鼠全部死亡。結(jié)果顯示從病牛體內(nèi)分離到1株毒力較強(qiáng)的血清A型多殺性巴氏桿菌。

關(guān)鍵詞：牛呼吸道感染；病原菌；分離鑒定；A型多殺性巴氏桿菌

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)可以引起禽、豬、兔、牛、綿羊、山羊、野生動(dòng)物和人感染發(fā)病，主要表現(xiàn)為禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛出血性敗血癥、牛羊地方性流行性肺炎等。根據(jù)莢膜抗原和脂多糖的不同，可以將其分別分為5個(gè)血清型(A、B、D、E、F)和16個(gè)血清型(1～16)，不同的血清型常與特定疾病相關(guān)聯(lián)[1-2]。產(chǎn)毒素的血清D型能導(dǎo)致豬的萎縮性鼻炎；而B(niǎo)和E群則主要導(dǎo)致非洲和亞洲地區(qū)的牛和水牛出血性敗血病[2-4]。我國(guó)以前主要以引起牛出血性敗血癥的莢膜血清B 型Pm為主[5]，自2008年馬文戈首次報(bào)道牛感染莢膜血清A型Pm[6]以來(lái)，相繼在我國(guó)大部分省、市、地區(qū)都有報(bào)道，牛纖維素性化膿性肺炎是2008年以來(lái)引起我國(guó)牛高病死率的牛傳染病。臨床上多以牛精神不振、呼吸困難、咳喘、鼻腔流出水樣或黏液樣的分泌物，體溫升高至40℃～42℃，消瘦為特征，有的還伴有腹瀉等癥狀，甚至突然死亡。莢膜血清A型Pm是牛呼吸道綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)主要的病原菌之一[7]。BRDC是牛最常見(jiàn)的一類(lèi)傳染病，該病致病因素復(fù)雜，發(fā)病快，傳染快，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，又稱“運(yùn)輸熱”，廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)統(tǒng)計(jì)，養(yǎng)牛業(yè)中65%的疾病與牛呼吸道疾病相關(guān)，發(fā)病率達(dá)50%～100%，病死率可達(dá)10%～50%[8-9]。

隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的迅速發(fā)展，近年來(lái)新疆多地區(qū)已投入大量資金以多種形式相繼建立多個(gè)初具規(guī)模的養(yǎng)牛場(chǎng)，但同時(shí)以呼吸道癥狀為主的傳染病也頻繁發(fā)生。本研究以新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；?chǎng)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、食欲下降、消瘦甚至死亡的病牛為研究對(duì)象，采集病變組織，采用細(xì)菌常規(guī)分離鑒定技術(shù)和16 S rRNA序列分析來(lái)鑒定菌種，同時(shí)用PCR方法檢測(cè)Pm特異性Kmt-1基因以及各血清型特異基因，為本地區(qū)牛場(chǎng)呼吸道疾病病原種類(lèi)的確定、研制針對(duì)性疫苗以及診斷技術(shù)的研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料病料采自新疆石河子地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)送檢的因呼吸道引起死亡的牛肺臟組織。

1.1.2藥品試劑和儀器細(xì)菌生化鑒定儀及配套設(shè)備(VITEK 2 COMPACT)；梯度PCR儀(德國(guó)Biometra 070-851)；常用新藥敏紙片(35種)產(chǎn)品編號(hào)：C074，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；Taq酶、buffer、dNTP Mix、Marker等購(gòu)于Takara公司；麥康凱培養(yǎng)基、Tryptone、Yeast Extract等購(gòu)于 Oxiod 公司；腦心浸液肉湯(BHI)，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1病原微生物分離培養(yǎng)與鏡檢將病料接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，于37℃培養(yǎng)24 h后，分別劃線于50 mL/L脫纖維綿羊血瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進(jìn)行染色鏡檢。

1.2.2生化鑒定將分離純培養(yǎng)物在50 mL/L脫纖維綿羊血瓊脂接種劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，按照生化鑒定儀使用說(shuō)明書(shū)，使用生化鑒定儀(Vitek 2 Compact)進(jìn)行生化鑒定。

1.2.316 S rRNA、Kmt-1基因序列測(cè)定及Pm血清型鑒定細(xì)菌16 S rRNA基因、Pm特異型基因Kmt-1和Pm的各血清型特異性基因引物參考文獻(xiàn)[10-11]，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，PCR擴(kuò)增其16 S rRNA基因序列，擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min 20 s，34個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并送北京華諾時(shí)代科技有限公司測(cè)序。用NCBI中的Blast軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。PCR擴(kuò)增Kmt-1和Pm各特異性血清型基因，擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s,50℃～60℃ 30 s,72℃ 1 min，34個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表1　試驗(yàn)中使用的引物

1.2.4藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，使用常用35種新藥敏紙片，判定標(biāo)準(zhǔn)按照常用新藥敏紙片(35種)使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5小鼠致病性試驗(yàn)普通級(jí)成年昆明小鼠分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。將分離菌接種于肉湯液體培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)8 h～11 h，試驗(yàn)組小鼠腹腔接種菌液0.2 mL/只，對(duì)照組注射等體積肉湯液體培養(yǎng)基，觀察其精神狀態(tài)、食欲等，記錄每只小白鼠死亡時(shí)間。

2結(jié)果

2.1菌株分離培養(yǎng)特性和形態(tài)特征

剖檢觀察病牛的病變?cè)诜闻K，整個(gè)肺臟腫大、肉變、充血(圖1A)，病料分離菌株在血平板上生長(zhǎng)良好，黏稠而光滑圓潤(rùn)、灰白色、露珠狀、不溶血的菌落，挑取革蘭染色鏡檢，為革蘭陰性球桿菌(圖1B)；在麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)，在綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。

2.2分離菌株生化特性

經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定，分離的菌株與Pm生化反應(yīng)特點(diǎn)一致(表2)。

2.316 S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析和Pm血清型分型鑒定結(jié)果

16 S rRNA基因片段擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果分析表明，16 S rRNA基因片段全長(zhǎng)均約為1 500 bp，與GenBank中的巴氏桿菌16 S rRNA基因序列AY316317、NR-041809、AY299308、AF224298、JX975401、DQ286927、JQ404476、JX869945、KR006972等同源性達(dá)到99%，可以推測(cè)分離菌為Pm(圖2)。

Pm種特異性基因Kmt-1引物分別和莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD的引物雙重PCR擴(kuò)增，只有Kmt-1和hyaD-hyaC引物擴(kuò)增出近460 bp和1 046 bp的兩條特異性條帶，而Kmt-1和bcbD、Kmt-1和dcbF、Kmt-1和ecbJ、Kmt-1和fcbD都只擴(kuò)增出一條約460 bp特異性條帶(圖3)。結(jié)果表明，該分離Pm為莢膜血清型A型。

A.箭頭指發(fā)生肉變的肺臟組織;B.分離菌株革蘭染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

生化鑒定項(xiàng)目Biochemicalidentificationitems結(jié)果Results生化鑒定項(xiàng)目Biochemicalidentificationitems結(jié)果Results生化鑒定項(xiàng)目Biochemicalidentificationitems結(jié)果Results丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA-側(cè)金盞花醇ADO-吡咯烷基芳胺酶PyrA-L-阿拉伯醇IARL-D-纖維二糖dCEL-β-半乳糖苷酶BGAL-H2S-β-N-乙酰葡萄糖苷酶BNAG-谷氨酰芳胺酶AGLTp-D-葡萄糖dGLU-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶GGT-葡萄糖發(fā)酵OFF-β-葡萄糖苷酶BGLU-D-麥芽糖dMAL-D-甘露醇dMAN-D-甘露糖dMNE+β-木糖苷酶BXYL-β-丙氨酸芳酶BAlap-L-脯氨酸芳胺酶ProA-酯酶LIP-古老糖PLE-酪氨酸芳胺酶TyrA-尿素酶URE-D-山梨醇dSOR-蔗糖SAC+D-塔格糖dTAG-D-海藻糖dTRE-檸檬酸鹽(鹽)CIT-丙二酸鹽MNT-5-酮-葡萄糖苷5KG-乳酸鹽產(chǎn)堿ILATk-α-葡萄糖AGLU-琥珀酸鹽產(chǎn)堿SUCT-N-乙酰-β-半乳糖氨酶NAGA-α-半乳糖苷酶AGAL-磷酸酶PHOS+氨基乙酸芳酶GlyA-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶ODC-賴氨酸脫羧酶LDC-組氨酸同化IHISa-COURMARATE+β-葡萄糖苷酸酶BGUR-O/129耐受O129R-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶GGAA-L-蘋(píng)果酸鹽同化IMLTa-ELLMAN+L-乳酸鹽同化ILATa-

圖2　分離菌株16 S rRNA遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000;1～5.分別為鑒定Pm A型、B型、D型、E型和F型 6.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.Identification of Pm A-type,B-type,D-type,E-type and F-type respectively; 6.Negative control

圖3分離Pm的血清型鑒定結(jié)果

Fig.3Results of serotype identification of isolated Pm

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

按照常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3。分離的菌株對(duì)鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素耐藥，對(duì)其他30種抗生素敏感。

2.5致病性檢測(cè)結(jié)果

2.5.1小鼠人工感染結(jié)果注射菌液1 h后，小鼠出現(xiàn)精神不振，食欲下降； 4.5 h后，注射Pm的小鼠有1只死亡；5.5 h后，小鼠全部死亡，剖解發(fā)現(xiàn)肝臟充血腫大，對(duì)照組小鼠正常。

2.5.2感染小鼠的內(nèi)臟細(xì)菌分離鑒定無(wú)菌采集死亡小鼠肝臟和脾臟分離到與注射菌相同細(xì)菌，PCR均擴(kuò)增Pm特異性基因Kmt-1和hyaD-hyaC均得到特異性片段(460 bp和1 046 bp)，對(duì)照組小鼠肝臟、脾臟未檢測(cè)到相應(yīng)條帶(圖4)。

表3　分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：“R”耐藥;“I”中介;“S”敏感;“-”結(jié)果判定失敗。

Note:"R"Resistance;"I"Intermedium;"S"Sensitive;"-" Results failed.

M. DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000;1～13.小鼠內(nèi)臟分離菌株

3討論

Pm為需氧或兼性厭氧菌，生長(zhǎng)最適的溫度為37℃，pH7.2～7.4。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較嚴(yán)格，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)貧瘠[12]。本次分離株在初始分離純化時(shí)，在新鮮綿羊血瓊脂平板和加入葡萄糖的普通液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好。250 mL/L甘油、-80℃保存后，再次接種培養(yǎng)時(shí)，只在高營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，這可能是在傳代培養(yǎng)時(shí)，由于動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)與體外的培養(yǎng)環(huán)境的差異，致使菌株的某些生長(zhǎng)特性發(fā)生變化，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求也出現(xiàn)差異。分離菌株只對(duì)鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素耐藥，這與牛場(chǎng)對(duì)發(fā)病牛長(zhǎng)期大劑量的使用抗生素治療不無(wú)關(guān)系，該菌株對(duì)四環(huán)素、喹諾酮類(lèi)、頭孢類(lèi)、青霉素敏感，結(jié)果與楊寶鳳等人在2014年的試驗(yàn)結(jié)果相似。小鼠腹腔注射后，5.5 h內(nèi)小鼠就全部死亡，說(shuō)明該P(yáng)m對(duì)小鼠有極強(qiáng)的致病性。研究提示，A型Pm可能是牛群發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原，并且通過(guò)16S rRNA遺傳進(jìn)化分析，本研究分離的Pm與AY299308(Scotland)、JQ404476(XinJiang)、NR-041809(USA)都有較高的同源性。本試驗(yàn)也同時(shí)分離到了大腸埃希菌，在致病性試驗(yàn)中，小鼠在26 h后出現(xiàn)死亡，相對(duì)于分離的Pm，其致病性較弱。

牛A型Pm是引起牛呼吸道細(xì)菌感染的主要病原之一，由于廣泛的存在于牛的各個(gè)生長(zhǎng)階段，也經(jīng)常導(dǎo)致牛的產(chǎn)奶量下降，生長(zhǎng)性能減低，甚至死亡，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的影響。最近幾年我國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)呈現(xiàn)快速集約化發(fā)展，國(guó)內(nèi)外引種的不斷加大，各地區(qū)的牛只頻繁跨區(qū)域調(diào)動(dòng)，也因此引起牛的應(yīng)激，造成牛系統(tǒng)性疾病與日俱增。Pm的致病性主要跟菌株的脂多糖、莢膜及相關(guān)蛋白、外膜蛋白和產(chǎn)毒素有關(guān)[3]；Pm具有的外膜蛋白其功能受到各種選擇壓力的影響，能從不同程度展示不同菌株間的變化，常用來(lái)評(píng)定菌株間的差異，從而確定與流行病學(xué)的關(guān)聯(lián)，它作為一種選擇性屏障，可以阻止多種有毒分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，使細(xì)菌能在多種環(huán)境下生存[2]。我國(guó)目前商品化的疫苗主要以B型為主，而不同的血清型Pm之間的交叉免疫保護(hù)率較低，致使在臨床上預(yù)防Pm的傳統(tǒng)疫苗效果不佳[13-14]。因此，研制針對(duì)A型Pm的疫苗對(duì)防治牛呼吸道疾病，減少經(jīng)濟(jì)損失十分迫切。本研究臨床分離的A型Pm對(duì)研制相應(yīng)的疫苗及診斷技術(shù)提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]Carter G R,Chengappa M M. Recommendations for a standard system of designating serotypes ofPasteurellamultocida[J].Asso Vet Lab Diagn,1981,24:37-42.

[2]裴志花，曲桂娟，馬紅霞，等.多殺性巴氏桿菌外膜蛋白研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49(1)：48-50.

[3]蔡廣強(qiáng).多殺性巴氏桿菌毒力因子研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013(6)：7-9.

[4]汪漫，胡長(zhǎng)敏，陳穎鈺.牛A型多殺性巴氏桿菌分離株的鑒定和免疫原性研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49(10)：3-10.

[5]楊寶鳳，李能章，鄒靈秀，等.6株牛源A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36(6)：487-489.

[6]馬文戈，于力.牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(10)：747-750.

[7]馬文戈，姜志剛，于力.牛莢膜血清A型巴氏桿菌病的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(5)：360-364.

[8]馮思源，馬建偉，杜慧慧，等.牛源A型多殺性巴氏桿菌pm0979和pm0442基因編碼蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36(10)：797-800.

[9]范穎，張繼瑜，周緒正，等.牛呼吸道疾病的病原學(xué)與防制研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40(1)：157-163.

[10]Townsend K M, Boyce J D, Chung J Y, et al.Genetic organization ofPasteurellamultocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system [J].J Clin Microbiol，2001，39(3)：924-929.

[11]肖淦文，陳穎鈺，彭清潔，等.牛支原體、巴氏桿菌A型和化膿隱秘桿菌多重PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)奶牛，2012，21：4-9.

[12]楊正時(shí)，房海.人及動(dòng)物病原細(xì)菌[M].河北石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，2003：820-842.

[13]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：136.

[14]王洪梅，趙貴民，候佩莉，等.牛呼吸道疾病綜合征流行現(xiàn)狀及防控技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志，2015，51(16)：33-39.

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test ofPasteurellamultocidafrom A Large-scale Cattle Farm in Shihezi Xinjiang

LIU Shun-lei1,2,HE Yan-hua2,WANG Xi-chu1,ZHENG Ting-ting1,KONG Ke-wei1,ZHOU Xia1,ZHONG Fa-gang2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China;2.XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationScience,Shihezi832000,China)

Abstract:To identify the pathogeny of causing dyspnea,cough,emaciation and death of cattle in an intensive cattle farm in Shihezi region,we isolated bacteria from tissue lesions and used routine isolation and identification methods and 16S rRNA sequence analysis to identify its species.With the use of primers fromPasteurellamultocidaspecies-specific gene Kmt-1 and serotype-specific genes(hyaD-hyaC,bcbD,dcbF,ecbJ,fcbD),we employed PCR to amplify relevant genes for the identification.K-B disk diffusion method and a murine infection model were also used. Results showed that we isolated a strain with a hoar,dewdrop-like,none hemolysis clone which is a type of Gram-negative rhabditiform bacteria.Biochemical identification showed that it is consistent withPasteurella.And alignments to published sequences on NCBI showed a 99% identity withP.multocida; only Kmt-1 and hyaD-hyaC genes were amplified with PCR; The isolate was resistant to streptomycin,gentamicin,kanamycin and susceptible to 30 other antimicrobials,and all the infected mice died after challenge. Results showed we isolated a strain of serotype AP.multocidawith strong virulence from a sick cattle.

Key words:bovine respiratory tract infection; pathogenic bacterium; isolation and identification;serotype APasteurellamultocida

收稿日期：2015-10-14

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2014AA001-3)；兵團(tuán)第八師科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2015TD07); 國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD43B00); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460663)

作者簡(jiǎn)介：劉順磊(1990-)，男，河南羅山人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治工作。*通訊作者

中圖分類(lèi)號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0040-05