鄒　勇，吳　飛，郭雅旭，耿曉蕊，張文慧，王玉霞，李希來，林　青,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100; 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

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西北部分地區(qū)豬蛔蟲rDNA ITS基因序列測(cè)定及遺傳變異分析

鄒勇1，吳飛1，郭雅旭1，耿曉蕊1，張文慧1，王玉霞1，李希來2，林青1,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100; 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

摘要：為了摸清西北部分地區(qū)豬蛔蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的遺傳變異特點(diǎn)，擴(kuò)增了豬蛔蟲ITS基因，進(jìn)行測(cè)序，依據(jù)GenBank公布的ITS序列將測(cè)序結(jié)果截為ITS1、5.8S及ITS2三段，分析比對(duì)各段序列的差異性。結(jié)果顯示，所有樣品ITS序列長約1 000 bp，其中ITS1、5.8S和ITS2的長度分別為450 bp～453 bp、159 bp、272 bp，種內(nèi)差異分別為0～0.2%、0、0?；贗TS1的種系發(fā)育分析表明，23個(gè)豬蛔蟲樣品均位于同一分支，而與貝蛔屬蛔蟲分屬兩個(gè)不同分支。ITS1序列不能作為區(qū)分西北不同地區(qū)豬蛔蟲的種內(nèi)分子標(biāo)記，但可以作為區(qū)分蛔屬蛔蟲與貝蛔屬蛔蟲的種間分子標(biāo)記，研究結(jié)果為豬蛔蟲的鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：豬蛔蟲； 核糖體DNA；轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；序列測(cè)定；遺傳變異

豬蛔蟲病(Ascariasis)是由豬蛔蟲(Ascarissuum)寄生于豬小腸引起的一種線蟲病，該病呈全球性分布，我國豬蛔蟲感染率為17%～80%[1]。患豬生長受阻、飼料回報(bào)率低、肉品質(zhì)下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。豬蛔蟲的幼蟲在“移行”的過程中可導(dǎo)致豬肝臟、肺臟、呼吸道等器官出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)肝表面出現(xiàn)“乳斑”、肺臟出現(xiàn)水腫[2-4]。此外，豬蛔蟲還能感染猩猩、長臂猿等靈長類動(dòng)物以及人[5-6]。因此，準(zhǔn)確鑒定豬蛔蟲分離株具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)及畜牧學(xué)意義。傳統(tǒng)的豬蛔蟲分類鑒定?；谛螒B(tài)學(xué)特點(diǎn)[7]，難以區(qū)分由于宿主及地理等環(huán)境等因素引起的變異蟲株。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定已成為寄生蟲蟲種、亞種及遺傳變異最直接的鑒定方法[8]。核糖體DNA(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)位于18S和28S基因之間，包含ITS1、5.8S和ITS2共3個(gè)基因片段[9]，由于該段序列具有復(fù)制倍數(shù)多、選擇壓力低、進(jìn)化速度快及長度序列變異大且在種內(nèi)及種間均存在變異的特點(diǎn)[10-11]，因此該段序列作為遺傳分子標(biāo)記已廣泛的應(yīng)用于多種寄生蟲的分類鑒定[12-13]。目前，豬蛔蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究主要集中于豬蛔蟲與人蛔蟲的分類鑒別方面[14-16]，而國內(nèi)關(guān)于不同地域豬蛔蟲群體的種內(nèi)變異未見報(bào)道。

本研究以西北不同地區(qū)(陜西周至、甘肅武威、寧夏青銅峽和青海西寧)豬蛔蟲分離株為試驗(yàn)對(duì)象，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增其rDNA ITS基因，通過分析該基因的遺傳變異情況并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，評(píng)估該基因序列作為種內(nèi)分子標(biāo)記的可能性，為豬蛔蟲的鑒定和分子流行病學(xué)調(diào)查提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲體樣品豬蛔蟲樣品共23條，分別采自于陜西周至、甘肅武威、青海西寧及寧夏青銅峽某生豬屠宰場(chǎng)(表1)。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為豬蛔蟲，用清水洗凈蟲體表面的糞便后，置于750 mL/L的乙醇中固定，置-20℃保存并做好標(biāo)記。

1.1.2試劑2×TaqMaster Mix試劑為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒為天根生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂為Amresco公司產(chǎn)品； DNA Marker DL 2 000、溴化乙錠和6×Loading buffer為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；柱式DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PMEG-T Easy載體試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；無水乙醇為天津福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1蟲體基因組DNA的提取將單個(gè)蟲體從750 mL/L的乙醇保存溶液中取出，置于無菌的平皿中，用滅菌蒸餾水反復(fù)沖洗2次～3次，截取一小段約1 cm的蟲體置于經(jīng)高壓滅菌處理過的1.5 mL的離心管中，用滅菌的眼科剪將蟲體剪碎，加入200 μL GA buffer，用研磨棒反復(fù)研磨至勻漿狀，再加入20 μL蛋白酶K，充分混勻，水浴56℃過夜消化，將消化完全的組織液按基因組DNA提取試劑盒說明書提取豬蛔蟲DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　豬蛔蟲成蟲樣品分離株信息

1.2.2PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件采用通用引物NC5/NC2[17]擴(kuò)增豬蛔蟲分離株的ITS基因，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，上游引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCAT- T-3′，下游引物NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件為： 95℃ 5 min；94℃ 40 s， 50℃ 40 s， 72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。取3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混合均勻后，小心加樣于10 g/L TBE瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，以相同體積的DNA Marker DL 2 000作為對(duì)照進(jìn)行電泳，設(shè)定電泳條件為100 V、電泳時(shí)間30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3ITS基因序列的克隆及測(cè)序?qū)㈥栃訮CR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在紫外透射儀中切割含有目的條帶的膠塊，置于經(jīng)高溫滅菌處理過的1.5 mL離心管中，按柱式DNA膠回收試劑盒說明書操作，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行純化，置-20℃保存?zhèn)溆?。將回收產(chǎn)物連接到PMEG-T Easy載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，無菌挑選白色的單菌落接種于含有1 000 μL和1.5 μL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，并做好標(biāo)記，置于搖床上37℃、200 r/min搖床10 h。按照ITS擴(kuò)增體系對(duì)菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，選取與DNA的PCR產(chǎn)物條帶大小一致的菌液，送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.4序列分析及種系進(jìn)化樹的構(gòu)建將測(cè)序結(jié)果拼接后在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，依據(jù)NCBI上公布的ITS基因序列(登錄號(hào)：AB571302)，將所測(cè)ITS序列結(jié)果截為ITS1、5.8S和ITS2。用Clustal 1.83軟件分別對(duì)不同基因序列進(jìn)行比對(duì)，利用DNAstar 5.0 軟件中的Megalign程序進(jìn)行同源性比對(duì)并計(jì)算種間及種內(nèi)差異。從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索現(xiàn)有蛔目ITS1基因序列，以雞蛔蟲為外群(Ascaridiagalli，登錄號(hào)：AM408550)，以人蛔蟲(Ascarislumbricoides，登錄號(hào)：AB571295)、浣熊貝蛔蟲(Baylisascarisprocyonis，登錄號(hào)：JQ403615)、西氏貝蛔蟲(Baylisascarisschroederi，登錄號(hào)：JN210911)、獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina，登錄號(hào)：JF837178)及橫走貝蛔蟲(Baylisascaristransfuga，登錄號(hào)：AB571304)為參考蟲株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用MEGA4.0程序中的鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)，選用Kimura2-parameter模式繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自展檢驗(yàn)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性，復(fù)制數(shù)均為1 000。

2結(jié)果

2.1豬蛔蟲r DNA ITS基因擴(kuò)增

對(duì)采自陜西周至、寧夏青銅峽、青海西寧和甘肅武威四個(gè)地區(qū)的23條豬蛔蟲樣品的ITS基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長約1 000 bp的片段，與預(yù)期目的片段長度相符，且無非特異性條帶(圖1)。

2.2ITS基因序列比對(duì)及遺傳變異分析

23個(gè)豬蛔蟲分離株樣品的ITS基因的序列長度相同，剔除兩端的引物序列后，得到881 bp～884 bp的序列，其中ITS1長度為450 bp～453 bp，5.8S長度為159 bp，ITS2長度為272 bp。對(duì)所有豬蛔蟲樣品的ITS1、5.8S和ITS2序列經(jīng)Clustal 1.83軟件比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)5.8S和ITS2的核苷酸無堿基的顛換和置換，相似性為100%，這與朱興全等的研究結(jié)果相一致[17]。對(duì)所有豬蛔蟲樣品的ITS1序列進(jìn)行兩兩比較(圖2)，ITS1的種內(nèi)變異為0～0.2%，相似性為98.7%～100%。來自甘肅武威、青海西寧、寧夏青銅峽地區(qū)豬蛔蟲ITS1序列的種內(nèi)差異均為0～0.2%，而陜西周至地區(qū)的6個(gè)豬蛔蟲樣品則未檢測(cè)到種內(nèi)變異。本試驗(yàn)樣品與人蛔蟲(AB571295)的屬內(nèi)種間差異為0.4%～0.7%，與浣熊貝蛔蟲(登錄號(hào)：JQ403615)的種間差異為10.6%～10.9%，與西氏貝蛔蟲(登錄號(hào)：JN210911)的種間差異為12.9%～13.3%，與橫走貝蛔蟲(登錄號(hào)：AB571304)的種間差異為11.2%～11.5%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～6.青海分離株QH1、QH2、QH3、QH4、QH5、QH6；7～11.寧夏分離株NX1、NX2、NX3、NX4、NX5；

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析

為了研究西北不同地區(qū)豬蛔蟲的遺傳進(jìn)化關(guān)系，基于ITS1 rDNA基因采用Mega 4.0軟件中的鄰接法(Neighbour-joining，NJ)、最大似然法(Maximum likelihood，ML)構(gòu)建蛔目系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),節(jié)點(diǎn)處數(shù)據(jù)由左至右依次為NJ/ML的Bootstrap值(%)。所有不同地區(qū)的豬蛔蟲分離株與豬蛔蟲參考株(登錄號(hào)：AB571302)位于同一分支并與人蛔蟲(登錄號(hào)：AB571295)合為姐妹支。浣熊貝蛔蟲(登錄號(hào)：JQ403615)、西氏貝蛔蟲(登錄號(hào)：JN210911)及橫走貝蛔蟲(登錄號(hào)：AB571304)聚類在另一分支，與豬蛔蟲和人蛔蟲所處分支合為一大支，隨后再與獅弓首蛔蟲(登錄號(hào)：JF837178)所在分支聚攏。所有豬蛔蟲分離株聚類在同一分支，但不能將不同地區(qū)分離株分開。

圖3西北部分地區(qū)豬蛔蟲分離株種群遺傳進(jìn)化樹(NJ/ML)法

Fig.3Phylogenetic tree ofA.suumisolated from different regions in northwest China，using NJ and ML methods

3討論

遺傳變異普遍存在于各種生物中，基于分子生物學(xué)的鑒別方法已成功用于寄生蟲的分類鑒定[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)樣品的5.8S和ITS2基因序列無種內(nèi)變異，ITS1的種內(nèi)變異為0～0.2%，相似性為98.7%～100%。來自甘肅武威、青海西寧、寧夏青銅峽地區(qū)豬蛔蟲ITS1序列的種內(nèi)差異均為0～0.2%，而陜西周至地區(qū)的6個(gè)豬蛔蟲樣品則未檢測(cè)到種內(nèi)變異。說明西北不同地區(qū)豬蛔蟲ITS基因中的5.8S和ITS2序列十分保守，而ITS1序列存在種內(nèi)變異，但變異率較低。而與人蛔蟲(AB571295)的屬內(nèi)種間差異為0.4%～0.7%，與浣熊貝蛔蟲(登錄號(hào)：JQ403615)的種間差異為10.6%～10.9%，與西氏貝蛔蟲(登錄號(hào)：JN210911)的種間差異為12.9%～13.3%，與橫走貝蛔蟲(登錄號(hào)：AB571304)的種間差異為11.2%～11.5%，說明ITS1基因的種內(nèi)變異小而種間變異大?；贗TS1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的豬蛔蟲與豬蛔蟲參考株(登錄號(hào)：AB571302)位于同一分支并與人蛔蟲(登錄號(hào)：AB571295)合為姐妹支。并與浣熊貝蛔蟲(登錄號(hào)：JQ403615)、西氏貝蛔蟲(登錄號(hào)：JN210911)及橫走貝蛔蟲(登錄號(hào)：AB571304)聚類在另一分支，與豬蛔蟲和人蛔蟲所處分支合為一大支，隨后再與獅弓首蛔蟲(登錄號(hào)：JF837178)所在分支聚攏。說明分離的蛔蟲樣品均確定為豬蛔蟲，且與人蛔蟲關(guān)系最近。所有豬蛔蟲分離株聚類在同一分支，但不能將不同地區(qū)分離株分開。說明ITS1基因不能揭示不同地區(qū)豬蛔蟲的種內(nèi)遺傳差異，該基因不能作為鑒別不同地區(qū)豬蛔蟲的分子標(biāo)記。所有豬蛔蟲分離株與貝屬蛔蟲位于兩個(gè)不同分支上，說明豬蛔蟲與貝屬蛔蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，即ITS1基因可以作為鑒定豬蛔蟲與貝屬蛔蟲的種間分子標(biāo)記。研究結(jié)果為中國西北地區(qū)豬蛔蟲的鑒定及分子流行病學(xué)調(diào)查提供了基礎(chǔ)資料。

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Sequencing and Phylogenetic Analysis on rDNA ITS Genes ofAscarissuumisolates from Different Regions in Northwest China

ZOU Yong1,WU Fei1,GUO Ya-xu1,GENG Xiao-rui1,ZHANG Wen-hui1,WANG Yu-xia1,LI Xi-lai2,LIN Qing1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi,712100,China;2.CollegeofAgricultureandAnimalHusbandry,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai,810016,China)

Abstract:To illuminate the genetic variation characteristics ofAscarissuumisolated from different regions in northwest China,the internal transcription spacer (ITS) genes were amplified by using the PCR method with the conserved primers NC5/NC2.After the amplicons were cloned and sequenced,the sequencing results were divided into ITS1,5.8S and ITS2 according to the public sequence in GenBank.And then those genes were compared and aligned to build phylogenetic tree.The results showed that the ITS genes of allA.suumsamples were amplified successfully with the length of 1 000 bp approximately,including 450 bp-453 bp for ITS1,159 bp for 5.8S and 272 bp for ITS2 and the intra-specific differences were 0-0.2% for ITS1,0 for 5.8S,0 for ITS2.Phylogenetic analysis displayed that allA.suumsamples were monophyletic groups and located in different clusters with the reference sequences of the genusBaylisascaris.Therefore,the ITS genes were not suitable to serve as molecular marker to distinguish theA.suumisolates from different regions in northwest China,but it can be used as intraspecific genetic marker to identify the generaAscarisandBaylisascaris.Those findings may provide basic data for the identification and molecular epidemiology investigation ofA.suum.

Key words:Ascarissum; rDNA ITS gene; sequencing; genetic diversity

收稿日期：2015-11-17

基金項(xiàng)目：教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT13074);科技部國際合作項(xiàng)目(2015DFG31870)

作者簡(jiǎn)介：鄒勇(1988-)，男，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫病防治研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S852.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0035-05