陳盛峰，陳　佳，禤金彩，龍　寒，袁漢文,何秀苗,2*

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，廣西南寧 530006；2.廣西民族大學(xué)廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西南寧 530006)

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北海近岸養(yǎng)殖海域3種弧菌的分離鑒定及耐藥性分析

陳盛峰1，陳佳1，禤金彩1，龍寒1，袁漢文1,何秀苗1,2*

(1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，廣西南寧 530006；2.廣西民族大學(xué)廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室，廣西南寧 530006)

摘要：對北海近岸養(yǎng)殖海域的3種弧菌(Vibrio)進(jìn)行了分離鑒定，并對鑒定的弧菌進(jìn)行耐藥性分析。通過從北海近岸養(yǎng)殖海域隨機采集水樣，利用TCBS培養(yǎng)基對所采水樣進(jìn)行弧菌的分離和純化，采用PCR方法和序列分析對弧菌進(jìn)行鑒定，并對鑒定出的3種弧菌進(jìn)行了常用抗菌藥物耐藥性的檢測。共分離獲得67株疑似弧菌菌株，經(jīng)鑒定，19株為副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，4株為霍亂弧菌(Vibriocholera)，4株為河流弧菌(Vibriofluvialis)。耐藥性分析研究表明，19株副溶血性弧菌總體顯示對10種常用抗菌藥物具有耐藥性，其中100%的菌株對四環(huán)素、卡那霉素和紅霉素表現(xiàn)耐藥，94.7%的菌株對氨芐西林耐藥、84.1%的菌株對左氧氟沙星和78.9%的菌株對環(huán)丙沙星耐藥；4株霍亂弧菌和4株河流弧菌對10種抗菌藥物的耐藥性均較強，但敏感度低，兩者對復(fù)方新諾明均表現(xiàn)為中介敏感。本研究提示,北海近岸養(yǎng)殖海域中弧菌種類較多，其中以副溶血性弧菌為主，大多對常用抗菌藥物具有耐藥性，對北海近岸海水養(yǎng)殖疾病防治具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：弧菌；分離；鑒定；養(yǎng)殖海域；耐藥性

海洋弧菌廣泛分布在各類河口海區(qū)、近岸養(yǎng)殖海域、灣和遠(yuǎn)洋海域等，主要泛指異營養(yǎng)、好鹽性海洋細(xì)菌中具有發(fā)酵葡萄糖等糖類能力的革蘭陰性桿菌，其數(shù)量巨大，在海洋環(huán)境中占據(jù)著優(yōu)勢地位。其中部分弧菌種類，如副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌等對海洋魚類、蝦和貝類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物和人類具有致病性[1]。近年來人類因食用感染了病原菌的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物而導(dǎo)致的急性腹瀉，嘔吐等疾病屢見不鮮。劉秀梅[2]等研究了國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)資料，發(fā)現(xiàn)目前微生物引起的食源性疾病是中國主要的食品安全問題，其中副溶血性弧菌是最主要的食源性致病菌[3]；由創(chuàng)傷弧菌引起的致死率超過半數(shù)[4]，如果未在72 h內(nèi)處理，致死率可達(dá)到100%[5]；霍亂弧菌引發(fā)的急性病在中國國內(nèi)各大城市中也常被報道[6-7]；由河流弧菌引起的癥狀與霍亂引起的癥狀相似，臨床表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)燒、脫水等癥狀，在歐洲、美國、中東及東南亞地區(qū)均有發(fā)生[8]，使得這些弧菌逐漸成為公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點。廣西北部灣位于中國南海西北部，海產(chǎn)資源豐富，生態(tài)環(huán)境多樣化。隨著海洋資源的不斷開發(fā)和利用，海水養(yǎng)殖規(guī)模也不斷擴大，海水養(yǎng)殖環(huán)境中由弧菌引起的病害日益盛行，嚴(yán)重制約著該地區(qū)海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，加強北部灣海水養(yǎng)殖海域弧菌的流行病學(xué)監(jiān)測，如弧菌的分離鑒定及其耐藥性分析對于弧菌病的防控具有重要意義。本研究從廣西北海地區(qū)近岸海水養(yǎng)殖比較集中的水域采集水樣，對弧菌進(jìn)行初步分離，并對較常見的具有致病潛力的副溶血性弧菌、霍亂弧菌和河流弧菌進(jìn)行鑒定，同時對3種弧菌的耐藥情況進(jìn)行檢測，旨在初步了解北海近岸養(yǎng)殖海域部分弧菌，特別是副溶血性弧菌、霍亂弧菌和河流弧菌的污染及其耐藥情況，為該地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

2014年8月份從廣西北海海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)較集中的營盤、竹林和石頭埠采集海水樣品。以養(yǎng)殖海域中心方圓30 m為采樣區(qū)域，以正方形的4個點和中心點設(shè)置5個采樣點，每個采樣點以2 m縱深采集水樣，3個不同海域各采集5個水樣，每個水樣將各采樣點隨機采集的3個樣品混合作為1個水樣進(jìn)行分析，每份各取50 mL，共15份，所采集的樣品4℃低溫保存。硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司；Lysis buffer for microorganism to direct PCR、Taq酶和dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司;其他所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。LB液體基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉(NaCl) 5 g/L，蒸餾水0.5 L，人工海水0.5 L，pH7.0；LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L制成，pH7.0；TCBS培養(yǎng)基按說明進(jìn)行配制；所有培養(yǎng)基均需經(jīng)過高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成根據(jù)副溶血性弧菌、霍亂弧菌和河流弧菌的相關(guān)基因[9]設(shè)計3對引物用于相應(yīng)弧菌的分子鑒定，引物序列如表1所示，由中國華大基因公司合成。

表1　引物序列

1.2.2菌株篩選與純化將采集的水樣與無菌海水充分混合后，連續(xù)做10倍遞進(jìn)稀釋，得到10-1～10-6的不同稀釋度。每個稀釋度分別取100 μL涂布于TCBS固體平板中，每個稀釋度做5個平行，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取特征菌落，分別劃線至新的TCBS培養(yǎng)基平板，倒置于恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)一步分離得到單一、純化的菌落。將所分離的所有菌落進(jìn)行編號，并記錄其大小、形狀、顏色、黏度等形態(tài)特征。獲得的單菌落進(jìn)行甘油冷凍保存，備用。

1.2.3PCR鑒定及序列分析將分離保存菌株接種TCBS平板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，具體如下：挑取單菌落置于含有50 μL Lysis buffer for microorganism to direct PCR的1.5 mL離心管中，80 ℃水浴鍋中變性15 min，取5 μL上清液做PCR模板。PCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 mmol/L 1.0 μL，引物各0.5 μL，Taq酶1.25 μL，補滅菌雙蒸水至25 μL。按以下反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴增：94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后送中國華大基因有限公司測序，序列與NCBI上已發(fā)表的相應(yīng)弧菌的相應(yīng)序列利用Lasergene軟件進(jìn)行同源性比較，以證實PCR產(chǎn)物的正確性，所用的參考株序列如下：副溶血弧菌NZ-AWJG01000125、NZ-AWHT01000101、NA-JNTJ01000249、NZ-AWMD 01000068和NZ-AWMC01000092；河流弧菌AF 170885、ASXS01000001和ASXT01000022；霍亂弧菌X51746、AF117836、Y00557、AF194418和AF117833。

1.2.4弧菌藥物敏感性試驗鑒定后的弧菌通過紙片擴散法(K-B法)進(jìn)行常用藥物的敏感性檢測。菌液均勻涂布LB固體培養(yǎng)基平板，無菌夾取藥敏試紙紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，每個培養(yǎng)皿放置5個藥物紙片，相鄰紙片等距離>2.0 cm。然后倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～48 h后，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，每株菌進(jìn)行3次重復(fù)試驗，取其抑菌圈直徑平均值。所用藥敏試紙包括頭孢他啶、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星10種抗菌藥物。按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)對分離弧菌對相應(yīng)藥物的敏感、中介敏感和耐藥情況進(jìn)行判定[10]。

2結(jié)果

2.1弧菌的分離

通過TCBS培養(yǎng)基從采集的水樣中分離純化得到67株疑似弧菌菌株，菌株在TCBS平板中呈黃色或綠色，不同菌株菌落大小略有不同。其中黃色菌落中直徑最大的達(dá)到2 mm～4 mm，較小為1 mm～2 mm；綠色菌落都比較大，直徑為3 mm～5 mm。黃色和綠色單菌落形狀都是圓形，邊緣規(guī)則，菌落光滑有光澤，表面凸起，質(zhì)地黏稠。

2.2PCR鑒定結(jié)果及序列分析

提取67株分離純化所得的菌株的DNA分別進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示67株菌株中有19株出現(xiàn)330 bp的目的條帶，與副溶血性弧菌的鑒定結(jié)果一致，隨機挑取其中5株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，并與NCBI上已經(jīng)公布的副溶血性弧菌菌株的hutA基因進(jìn)行同源性比對，結(jié)果5株分離弧菌與參考株的同源性均達(dá)到98%～99%之間；有4株出現(xiàn)427 bp的目的條帶，與霍亂弧菌一致，4株分離株的PCR產(chǎn)物序列與霍亂弧菌的hlyA基因的同源性達(dá)到96%～100%；有4株出現(xiàn)217 bp的目的條帶，與河流弧菌的鑒定結(jié)果一致，4株分離株的PCR產(chǎn)物序列與河流弧菌參考株的toxR基因的同源性則達(dá)到91%～93%；其余菌株未能成功擴增出如上目的片段，而陰性對照組均無陽性條帶擴出(圖1)。

A．M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL1 000；1.陰性對照；2、3、5 .霍亂弧菌；4、6.副溶血弧菌

2.3藥敏試驗結(jié)果

2.3.119株副溶血弧菌藥敏試驗結(jié)果19株副溶血性弧菌對頭孢他啶等10種抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果見表2。所有鑒定出的19株副溶血性弧菌均表現(xiàn)為對四環(huán)素、卡那霉素和紅霉素耐藥；表現(xiàn)為對氨芐西林、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥的分別達(dá)到18株、16株和15株，耐藥率較高；表現(xiàn)為對頭孢他啶和氯霉素中介敏感的達(dá)到11株和10株；表現(xiàn)為對鏈霉素、復(fù)方新諾明和氯霉素高度敏感的分別為5株、4株和3株。

表2　副溶血性弧菌藥敏試驗結(jié)果

2.3.24株霍亂弧菌藥敏試驗結(jié)果4株霍亂弧菌對頭孢他啶等10種抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果見表3。4株霍亂弧菌對頭孢他啶、四環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、氨芐西林和左氧氟沙星均表現(xiàn)為耐藥，對復(fù)方新諾明均表現(xiàn)為中介敏感，其中有3株對鏈霉素表現(xiàn)為耐藥，有3株表現(xiàn)為對氯霉素中介敏感，4株霍亂弧菌對所用的10種抗菌藥物均不敏感。

2.3.34株河流弧菌藥敏試驗結(jié)果4株河流弧菌對10種常用抗菌藥物的敏感性試驗結(jié)果見表4。4株河流弧菌對四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均表現(xiàn)為耐藥，對復(fù)方新諾明表現(xiàn)為中介敏感；其中有3株對頭孢他啶表現(xiàn)為耐藥，對氯霉素表現(xiàn)為耐藥和中介敏感的分別有2株，4株河流弧菌對10種抗菌藥物均不敏感。

表3　霍亂弧菌藥敏試驗結(jié)果

3討論

弧菌是廣泛存在于各類河口海區(qū)和近岸養(yǎng)殖海域等的革蘭陰性桿菌，副溶血弧菌、霍亂弧菌和河流弧菌均已被報道引起人類的腹瀉等疾病，并已在包括廣西在內(nèi)的海產(chǎn)品中檢出[8,11-12]。因此，對海產(chǎn)養(yǎng)殖海域進(jìn)行弧菌的分離鑒定及耐藥情況分析對于提高食品安全性具有重要參考意義。本研究利用TCBS培養(yǎng)基從北海近岸同一片養(yǎng)殖海域隨機采集水樣中成功分離獲得67株疑似弧菌菌株，并根據(jù)部分弧菌的特有基因，即河流弧菌的中央調(diào)節(jié)基因(toxR)、霍亂弧菌的溶血素基因(hlyA)以及副溶血弧菌的血紅素利用基因(hutA)設(shè)計引物對弧菌進(jìn)行PCR鑒定。Vinothkumar[9]等分別利用針對這3個基因的三重PCR成功完成了對來自227個樣品中主要弧菌，即河流弧菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌的鑒定，并證實，針對這3個基因的三重PCR方法對于河流弧菌、副溶血性弧菌和霍亂弧菌弧菌的檢測是特異、敏感和簡便的，可以用于臨床和環(huán)境樣品的檢測。通過PCR方法，本研究從分離純化的67株弧菌中鑒定出19株副溶血性弧菌、4株霍亂弧菌、4株河流弧菌，三者的檢出率達(dá)到40.3%(27/67)。此外，尚有40株疑似弧菌未能獲得最終鑒定，很有可能是其他種類的弧菌，有待進(jìn)一步的鑒定。本研究結(jié)果表明，廣西北海近岸養(yǎng)殖海域有弧菌污染，且弧菌的種類具有多樣性(3種以上)的趨勢，該結(jié)果與劉軍義[13]等和何蘋萍[14]等對廣西沿海海產(chǎn)品中弧菌的研究調(diào)查結(jié)果相似。此外，在本研究所鑒定的弧菌類型中，副溶血弧菌比例占了近70.4%(19/27)，與該地區(qū)周邊海域的檢測結(jié)果相似[15]，進(jìn)一步證實北海近岸養(yǎng)殖海域副溶血性弧菌污染嚴(yán)重。副溶血性弧菌作為海水中廣泛存在的一種人畜共患病原菌，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類公共衛(wèi)生都將是重要的威脅[16-17]，本研究結(jié)果對于北海近岸海域的海水養(yǎng)殖的防御提供了基礎(chǔ)資料。

本試驗結(jié)果表明，北海近岸水產(chǎn)養(yǎng)殖海域水樣中分離鑒定的副溶血性弧菌、霍亂弧菌和河流弧菌對頭孢他啶等8種抗菌藥物具有耐藥性，僅對復(fù)方新諾明和氯霉素表現(xiàn)出一定的敏感度，與相關(guān)學(xué)者的弧菌耐藥性研究結(jié)果相似[6,18]。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)同一樣品中的副溶血性弧菌、霍亂弧菌和河流弧菌具有相近的耐藥性，不同樣品中的相同弧菌類型表現(xiàn)的耐藥性基本一致，不同樣品的不同弧菌類型其耐藥性有所差異，但對大多數(shù)的抗菌藥物都顯示了耐藥性。研究所用的10種抗菌藥物大部分為海水養(yǎng)殖常用抗菌藥物。姚小娟[19]對分離自中國江蘇、福建、浙江和海南地區(qū)發(fā)病動物和養(yǎng)殖池塘的106株弧菌進(jìn)行了包括復(fù)方新諾明、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、和紅霉素在內(nèi)共14種水產(chǎn)常用抗菌藥物的耐藥性分析，結(jié)果表明分離的弧菌對常用的抗菌藥物大多表現(xiàn)出高度耐藥性，從北海地區(qū)水域分離的3種弧菌的耐藥性分析結(jié)果與該研究結(jié)相似，而這些耐藥性出現(xiàn)的原因有待于進(jìn)一步研究。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Analysis of ThreeVibrioSpecies in Aquaculture Area of Beihai

CHEN Sheng-feng1,CHEN Jia1,XUAN Jin-cai1,LONG Han1,YUAN Han-wen1,HE Xiu-miao1,2

(1.SchoolofMarineSciencesandBiotechnology/GuangxiCollegesandUniversitiesKeyLaboratoryofUtilizationofMicrobialandBotanicalResources,GuangxiUniversityforNationalities,Nanning,Guangxi,530006,China；2.GuangxiKeyLaboratoryofChemistryandEngineeringofForestProducts,Nanning,Guangxi,530006,China)

Abstract:This study aimed to isolate and identify marineVibrioin aquaculture area of Beihai,and then drug resistances of theVibriowere analyzed.Water samples were randomly collected from the aquaculture area of Beihai.Vibriowere isolated and purified from those water samples by TCBS medium.The PCR technique and sequence alalysis were used for further identification of theVibrio.Finally,antimicrobial sensitivity tests were carried out for these identifiedVibrio.The results indicated that 67 strains ofVibriowere successfully isolated,19 strains were identified asVibrioparahaemolyticus,4 strains wereVibriocholeraand 4 strains wereVibriofluvialis.Drug resistance results indicated that all of the 19Vibrioparahaemolyticusshowed overall performance of antimicdrobial resistance,100% ofVibrioparahaemolyticuswere resistant to tetracycline,kanamycin and erythromycin,94.7% of strains were resistant to ampicillins,84.1% of strains were resistant to levofloxacin and 78.9% of strains were resistant to ciprofloxacin. All of theVibriocholeraesandVibriofluvialisalso showed resistance to the 10 kinds of antimicrobials. Both of them were medium sensitive to compound sulfamethoxazole. The results showed that there are different kinds ofVibrioprevalent in aquaculture area of Beihai.Vibrioparahaemolyticusis the most commonVibrio. Most of the isolates display resistance to commonly used antimicrobials. This result would be an important guide for disease control in the aquaculture area of Beihai.

Key words:Vibrio; isolation; identification; aquaculture area; drug resistance

收稿日期：2015-10-30

基金項目：廣西民族大學(xué)2015研究生教育創(chuàng)新計劃項目(gxun-chxs2015090)；2014廣西民族大學(xué)相思湖青年學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目；廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新高水平研究項目(2013B01)

作者簡介：陳盛峰(1990- )，男，福建泉州人，碩士研究生，主要從事動物微生物與免疫學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.613;Q939.91

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0029-06