紀(jì)方曉，陳濟(jì)鐺，石慶偉，王　衡，張桂紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

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H3N2亞型豬流感病毒HA和HA1蛋白的原核表達(dá)

紀(jì)方曉，陳濟(jì)鐺，石慶偉，王衡，張桂紅*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

摘要：為原核表達(dá)H3N2亞型豬流感病毒(SIV)的HA和HA1蛋白，通過RT-PCR方法獲得SIV的HA和HA1基因，克隆至原核表達(dá)載體pMAL-c5X，并轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌Rosetta(DE3)中，表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果顯示，成功表達(dá)了H3亞型SIV的HA和HA1蛋白，目的蛋白均以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在，并與H3N2亞型SIV的HA單克隆抗體反應(yīng)，說明HA和HA1蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

關(guān)鍵詞：H3N2亞型豬流感病毒；HA蛋白；HA1蛋白；原核表達(dá)

豬流感(Swine influenza,SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、 呼吸困難、 精神沉郁、 高發(fā)病率、 低病死率為特征[1]。目前，全球豬群中主要以H1N1、H1N2和H3N2亞型SIV廣泛流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。豬是人流感病毒、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨種傳播的中間宿主，是流感病毒基因重組的“混合器”，是引起流感大暴發(fā)重要原因，因此，對(duì)于豬流感的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[4]。

A型流感病毒為正黏病毒科病毒，基因組為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，長約13.6 kb，編碼11種蛋白質(zhì)。其中片段4編碼的血凝素(HA)蛋白為流感病毒重要的糖蛋白之一，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，即信號(hào)肽、胞漿域、跨膜域、胞外域。HA蛋白空間結(jié)構(gòu)呈三聚體組成的棒狀，分頭、頸部，頭部由HA1構(gòu)成，含受體結(jié)合位點(diǎn)和抗決定簇原，頸部由部分HA1和HA2構(gòu)成[5]。HA蛋白可識(shí)別宿主細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，該抗體可以中和流感病毒[6]。因此，H3N2亞型SIV HA和HA1蛋白的研究對(duì)H3亞型SIV血清學(xué)診斷方法的建立以及疫苗的開發(fā)有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、菌種、質(zhì)粒H3N2亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/L22/2010 (H3N2)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離并保存；pMAL-c5X原核表達(dá)載體購自紐英倫生物技術(shù)有限公司；Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.2試劑H3N2亞型豬流感病毒血凝素(Hemagglutinin/HA)鼠單抗購自義翹神州生物有限公司；羊抗鼠熒光二抗(IRDye800標(biāo)記)購自LI-COR biosciences 公司；總RNA極速提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SalⅠ購自紐英倫生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒購自美國Omega公司；T4 DNA連接酶、高保真TaqDNA聚合酶等購自寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)應(yīng)用Signal P V2.0.b2 和TMHMM Server v.2.0生物學(xué)軟件對(duì)H3N2亞型豬流感病毒的HA基因進(jìn)行信號(hào)肽、跨膜區(qū)、胞外區(qū)分析，根據(jù)去除信號(hào)肽、跨膜區(qū)、胞外區(qū)的HA基因序列，用生物學(xué)軟件Oligo7.0分別設(shè)計(jì)HA、HA1兩對(duì)引物(表1)，由英濰捷基(上海)公司合成，上游引物加上NotⅠ的酶切位點(diǎn)，下游引物加上SalⅠ的酶切位點(diǎn)和HIS標(biāo)簽。

1.2.2HA、HA1基因的擴(kuò)增按總RNA極速抽提試劑盒說明書提取病毒RNA，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)獲得cDNA，再利用HA、HA1的特異性引物經(jīng)PCR獲得HA和HA1基因。

1.2.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定HA、HA1基因經(jīng)NotⅠ和SalⅠ酶切后，克隆至pMAL-c5X表達(dá)載體，構(gòu)建pMAL-c5X-HA和pMAL-c5X-HA1重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌液送英濰捷基公司測(cè)序并進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.4重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析陽性菌液培養(yǎng)至OD600 nm為0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，于30 ℃、 200 r/min誘導(dǎo)5 h。收集菌體在冰浴條件下超聲破碎，取沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5重組蛋白的Western blot分析重組蛋白HA、HA1進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)，用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，與1∶700稀釋的鼠源抗體4 ℃孵育過夜，再與1∶8 000稀釋IRDye 800 CW Goat anti-Mouse IgG (H+L) 二抗室溫孵育1 h，將NC膜放入雙色激光分析系統(tǒng)中掃膜分析。

表1　引物及其序列

2結(jié)果

2.1HA、HA1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增的HA和HA1基因經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)與目的基因大小一致的2條特異性條帶，分別為1 539 bp和987 bp(圖1)。

M．DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～2．HA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3～4．HA1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M．DNA Marker DL 2 000；1-2．PCR products of HA gene；3-4．PCR products of HA1 gene

圖1HA、HA1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR amplification of HA and HA1 genes

2.2重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pMAL-c5X-HA、pMAL-c5X-HA1測(cè)序結(jié)果與目的基因一致，并經(jīng)NotⅠ和SalⅠ雙酶切后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見與目的基因一致的條帶(圖2)，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

陽性菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)顯色后可見與目的蛋白大小一致的條帶(圖3)，HA1和HA蛋白加上MBP標(biāo)簽(40 ku)大小分別約為80 ku和100 ku。

2.4目的蛋白的可溶性分析

誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎后，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，上清和沉淀均存在目的蛋白(圖4)，即重組蛋白具有可溶性。

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000；1．pMAL-c5X-HA雙酶切；2．pMAL-c5X-HA1雙酶切

M．DNA Marker DL 10 000；1．Products of pMAL-c5X-HA digested byNotI andSalI；2． Products of pMAL-c5X-HA1 digested byNotⅠ andSalⅠ

圖2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.2Enzyme digestion identification of the recombinant plasmid

2.5重組蛋白的免疫原性分析

重組蛋白HA和HA1與H3N2亞型豬流感病毒血凝素鼠單抗反應(yīng)后，在NC膜上分別見到約為100 ku和80 ku的特異性條帶，證實(shí)了HA和HA1蛋白具有良好的反應(yīng)原性(圖5)。

M．蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．pMAL-c5X空載體誘導(dǎo)前；2．pMAL-c5X空載體誘導(dǎo)后；3．重組質(zhì)pMAL-c5X-HA1誘導(dǎo)前；4．重組質(zhì)粒pMAL-c5X-HA1誘導(dǎo)后；5．重組質(zhì)粒pMAL-c5X-HA誘導(dǎo)前；6．重組質(zhì)粒pMAL-c5X-HA誘導(dǎo)后

M．Protein molecular weight Marker；1．Products of pMAL-c5X without induction；2．Products of pMAL-c5X induced；3．Products of pMAL-c5X-HA1 without induction；4．Products of pMAL-c5X-HA1 induced；5．Products of pMAL-c5X-HA without induction；6．Products of pMAL-c5X-HA induced

圖3重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins

M．蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．pMAL-c5X空載體誘導(dǎo)后；2．pMAL-c5X-HA1誘導(dǎo)前；3．pMAL-c5X-HA1誘導(dǎo)后；4．pMAL-c5X-HA1菌液超聲破碎上清；5．pMAL-c5X-HA1菌液超聲破碎沉淀；6．pMAL-c5X-HA誘導(dǎo)前；7．pMAL-c5X-HA誘導(dǎo)后；8．pMAL-c5X-HA菌液超聲破碎上清；9．pMAL-c5X-HA菌液超聲破碎沉淀

M．Protein molecular weight Marker；1．Products of pMAL-c5X induced；2．Products of pMAL-c5X-HA1 without induction；3．Products of pMAL-c5X-HA1 induced；4．Supernatant of expression products of pMAL-c5X-HA1；5．Precipitates of pMAL-c5X-HA1；6．Products of pMAL-c5X-HA without induction；7．Products of pMAL-c5X-HA induced；8．Supernatant of expression products of pMAL-c5X-HA；9．Precipitates of pMAL-c5X-HA

圖4重組蛋白的可溶性分析

Fig.4Solublility analysis of the recombinant proteins

3討論

目前，豬流感病毒的抗體檢測(cè)主要用血凝抑制(HI)試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。HI試驗(yàn)操作簡單，但是血清中含有非特異性的紅細(xì)胞凝集因子，容易出現(xiàn)假陽性，需要用受體破壞酶(receptor destroying enzyme,RDE)或胰酶、高碘酸鉀等方法處理血清[7]。ELISA是實(shí)驗(yàn)室常用的一種檢測(cè)方法，其簡單、易行，適用于大批量的血清檢測(cè)。美國IDEXX公司于2006年研發(fā)了檢測(cè)豬流感病毒H1N1和H3N2亞型抗體的ELISA試劑盒，但現(xiàn)在已停產(chǎn)。因此，表達(dá)H3N2亞型流感病毒HA、HA1蛋白為建立H3亞型豬流感病毒抗體的檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。

M．蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．陰性對(duì)照；2．HA重組蛋白；3．HA1重組蛋白

M．Protein molecular weight Marker；1．Negative control；2．Recombinant protein HA；3．Recombinant protein HA1

圖5重組蛋白的Western blot分析

Fig.5Western blot analysis of the recombinant proteins

在現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)中，原核表達(dá)是實(shí)驗(yàn)室最為成熟的表達(dá)蛋白的系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、成本低、時(shí)間短、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是表達(dá)外源基因的首選系統(tǒng)[8]。相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)，大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)的加工、修飾體系不完善，目的蛋白不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，但抗體可以識(shí)別具有線性表位的抗原，因此，大腸埃希菌表達(dá)的蛋白仍具有反應(yīng)原性。有多名學(xué)者成功表達(dá)了H3N2豬流感病毒的HA蛋白，驗(yàn)證了該蛋白具有反應(yīng)原性，并以此建立了ELISA檢測(cè)方法，但HA蛋白多以包涵體形式存在[9-11]。

麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽由大腸埃希菌K12的malE基因編碼，大小約為40 ku，在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中可增加目的蛋白的溶解性，現(xiàn)有多名學(xué)者利用MBP標(biāo)簽成功表達(dá)了可溶性蛋白[12-13]。又因HIS標(biāo)簽易于蛋白的純化，本研究通過引物設(shè)計(jì)構(gòu)建了帶有HIS6-MBP組合標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c5X-HA和pMAL-c5X-HA1，成功表達(dá)了HA和HA1蛋白，并能與H3N2亞型豬流感病毒HA單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，說明了HA和HA1蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為H3亞型豬流感病毒的檢測(cè)試劑和疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)是在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

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Prokaryotic Expression of HA and HA1 Genes of H3N2 Swine Influenza Virus

JI Fang-xiao,CHEN Ji-dang,SHI Qing-wei,WANG Heng,ZHANG Gui-hong

(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgricultureUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

Abstract:To express the HA and HA1 proteins of H3N2 swine influenza virus,the HA and HA1 genes were amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pMAL-c5X.Recombinant plasmid pMAL-c5X-HA and pMAL-c5X-HA1 were transformed toE.coliRosetta (DE3) and induced with IPTG.The HA and HA1 proteins were expressed successfully in the forms of soluble proteins and inclusion bodies.What′s more,both of the HA and HA1 proteins could be recognized by HA antibody of H3N2 subtype,it revealed that the HA and HA1 proteins have good antigenicity.

Key words:H3N2 swine influenza virus; HA protein; HA1 protein; prokaryotic expression

收稿日期：2015-10-17

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-36)

作者簡介：紀(jì)方曉(1990-)，女，山東德州人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0022-04