孫永科，胡超英，林明星，陸欣然，楊玉艾

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

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豬瘟病毒石門(mén)株在ST細(xì)胞連續(xù)傳代后E0基因變異分析

孫永科，胡超英，林明星，陸欣然，楊玉艾*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

摘要：為了解豬瘟病毒(CSFV)石門(mén)(Shimen)株連續(xù)傳代后變異情況，根據(jù)已發(fā)表的CSFV E0基因序列(AF092448.2)，設(shè)計(jì)合成引物，以在ST細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)的CSFV石門(mén)株細(xì)胞毒總RNA為模板，每5代通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增病毒的E0基因，測(cè)定其核苷酸序列和氨基酸序列，用DNA Star軟件分析比較原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒細(xì)胞中CSFV E0基因的變異性。結(jié)果顯示，接種病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位點(diǎn)出現(xiàn)變異，第15代病毒在632核苷酸位點(diǎn)出現(xiàn)變異。本研究通過(guò)分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)CSFV Shimen株在ST細(xì)胞連續(xù)傳代過(guò)程中E0基因能保持遺傳的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒；連續(xù)傳代；ST細(xì)胞；E0基因；變異

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，具有流行廣泛、發(fā)病率和病死率高的特點(diǎn)，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。近年來(lái)，該病出現(xiàn)許多新特點(diǎn)，以非典型溫和型為主，給豬病防控帶來(lái)許多新的問(wèn)題。CSFV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，全基因組長(zhǎng)約12.3 kb[2-3]，包括4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Erns/E0、C、E1和E2)和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[4]，其中E0和E2能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，可誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生對(duì)致死量CSFV的保護(hù)性免疫，同時(shí)E0和E2也是病毒吸附進(jìn)入敏感細(xì)胞的必需蛋白[5]。E0蛋白是一種多功能性蛋白，由于編碼E0的核酸序列保守程度高，分子質(zhì)量約為 44 ku～50 ku，其同源二聚體分子質(zhì)量為97 ku，無(wú)疏水的膜錨定結(jié)構(gòu)，能直接從被感染的細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，為可分泌性蛋白并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體抵抗致死劑量CSFV的攻擊，因而E0也可作為防治豬瘟的一種靶蛋白[6]。E0蛋白具有神經(jīng)細(xì)胞毒性和抗凝集活性，CSFV感染動(dòng)物后所產(chǎn)生的E0蛋白在致病過(guò)程中起重要作用[7]。還參與病毒粒子黏附和侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程，用E0中和單抗可有效阻斷CSFV對(duì)易感動(dòng)物細(xì)胞的感染[8]。根據(jù)E0蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞有直接的毒性效應(yīng)，能引起淋巴細(xì)胞的凋亡，同時(shí)豬瘟病毒感染是以白細(xì)胞減少和免疫抑制為特征，因此認(rèn)為E0很可能與CSFV的致病性有關(guān)[9]。E0還具有RNase活性[10]，E0的這種RNase活性在病毒復(fù)制及病毒感染的致病機(jī)制中的作用一直備受關(guān)注。E0蛋白以同源二聚體形式存在于病毒粒子中，含有227個(gè)氨基酸，其中191-227 氨基酸具有豬瘟病毒特異性[11]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)CSFV E0基因進(jìn)行擴(kuò)增、核苷酸序列及氨基酸序列分析，用分子生物學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)E0遺傳變異特點(diǎn)，從而對(duì)研究該區(qū)域蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、鑒別診斷技術(shù)和豬瘟基因工程疫苗研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步了解CSFV的分子流行病學(xué)、遺傳變異及做好豬瘟的防控工作等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和病毒ST細(xì)胞、豬瘟病毒石門(mén)株由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程研究中心保存。

1.1.2引物參考GenBank中已公布的 CSFV石門(mén)株全基因組序列(AF092448.2)中的E0基因設(shè)計(jì)特異性引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為699 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物E0 U 5′-GGGCGGTAATAGCAATTATGT-3′，E0 L 5′-GGGGTGCAGTTGTTAGTATAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度699 bp。

1.1.3主要試劑DMEM培養(yǎng)基、血清、胰酶為Gibico公司產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；DEPC水、異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇、Random引物、RNA抑制劑、dNTP Mixture、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、exTaq聚合酶均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1ST細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)由液氮罐中迅速取出凍存的ST細(xì)胞(1.5 mL凍存管)，立即放入37℃水浴中，融化后緩慢放入盛有9 mL DMEM液的無(wú)菌離心管中，1 500 r/min室溫離心5 min，棄上清，將沉淀放入盛有10 mL含100 mL/L犢牛血清及10 mL/L雙抗的DMEM培養(yǎng)液的無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)36 h～48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待ST細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行細(xì)胞傳代，傾去培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS洗2次，加入2.5 g/L胰酶-EDTA 1 mL，輕搖數(shù)次，平放消化數(shù)分鐘，邊消化邊在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞分散、變圓，即將脫落時(shí)，棄胰酶，加入含有犢牛血清100 mL/L的DMEM培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，備用。

1.2.2病毒培養(yǎng)取生長(zhǎng)良好的ST單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS液清洗2次，按照1×103TCID50接種CSFV Shimen株，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1 h，其間輕搖2次，之后加入含終濃度20 mL/L～30 mL/L血清的DMEM，37℃培養(yǎng)，逐日觀察，5 d為一個(gè)傳代周期。傳代前細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，同樣方法進(jìn)行傳代。

1.2.3病毒總RNA的提取取細(xì)胞液400 μL于1.5 mL EP管中，加入600 μL TrizoL混勻，冰浴5 min；加200 μL氯仿，振蕩15 s～30 s，冰浴5 min，12 000 r/min、4℃離心15 min；小心吸取上清于1.5 mL EP管，加入等體積的異丙醇，緩慢顛倒數(shù)次，冰浴5 min，12 000 r/min、4℃離心10 min；棄上清，加750 mL/L乙醇1 mL，9 000 r/min、4℃離心5 min；棄上清，自然風(fēng)干后，DEPC水溶解。所有的EP管及槍頭均經(jīng)1 mL/L的DEPC水處理去除RNA酶。

1.2.4病毒cDNA的合成參照AMV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明，進(jìn)行兩步法RT-PCR獲得病毒的cDNA1.8E0基因片段的PCR擴(kuò)增，在一個(gè)體系中分別加入超純水、ExTaqbuffer、dNTP、TaqDNA 聚合酶、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物和引物。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 45 s，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 1min，53℃ 45 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取上述產(chǎn)物5 μL混合適量的buffer和花青素在7 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5核酸序列測(cè)定及分析將所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。利用DNA Star軟件分析比較多次細(xì)胞傳代的豬瘟病毒全基因組的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性、變異情況，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果

2.1E0基因的克隆

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)7 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在約800 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，其大小與預(yù)期的相符。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.陰性細(xì)胞對(duì)照；2.水對(duì)照；3.E0基因

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative cell control; 2.H2O control; 3.CSFV E0 gene

圖1CSFV E0基因PCR擴(kuò)增

Fig.1PCR amplification of CSFV E0 gene

2.2基因核苷酸序列比較

克隆測(cè)序后，用DNA Star 軟件將豬瘟毒Shimen株原代與5代、10代、15代、20代、25代E0基因的核苷酸序列進(jìn)行分析比較，結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出10代第630核苷酸位點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)變異，15代第632核苷酸位點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)變異，圖3顯示核苷酸序列的同源性為99.6%～100%，將核苷酸同源性分析結(jié)果繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4)。

2.3氨基酸序列分析

利用DNA Star軟件根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，可見(jiàn)發(fā)生核苷酸變異的位點(diǎn)氨基酸也發(fā)生改變(圖5)，氨基酸同源性為99.1%～100%(圖6)。

3討論

豬瘟病毒是單股正鏈RNA病毒，由于RNA聚合酶的校正活性，RNA病毒較易發(fā)生變異[12-13]。已有研究證實(shí)RNA病毒基因組在群落傳代過(guò)程中能夠產(chǎn)生廣泛的分子和抗原性改變[14]，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析也已經(jīng)證明豬瘟病毒野毒株之間存在著基因組的變異[15]。目前我國(guó)防控豬瘟的主要措施是疫苗免疫，豬瘟細(xì)胞苗則是其中一種，但在現(xiàn)行豬瘟細(xì)胞苗的使用過(guò)程中，往往出現(xiàn)免疫失敗諸多問(wèn)題，究其原因有報(bào)道認(rèn)為豬瘟病毒的抗原變異可能是導(dǎo)致該病毒逃逸免疫保護(hù)的主要原因。E0蛋白是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，同時(shí)也是一個(gè)相當(dāng)保守的蛋白，對(duì)編碼該蛋白的基因序列進(jìn)行變異分析，對(duì)研究CSFV抗原的變異性和多樣性有重要意義，同時(shí)有利于從分子水平上揭示近年來(lái)豬瘟病毒毒力變異及非典型豬瘟廣泛傳播的原因。

圖2　不同代次間E0基因核苷酸序列比較

圖3　不同代次間E0基因核苷酸序列同源性比較

圖4　不同代次間系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

本研究采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增了在ST細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)的豬瘟病毒石門(mén)株細(xì)胞毒E0基因，運(yùn)用DNA Star軟件分析比較多次細(xì)胞傳代后豬瘟病毒E0基因的核苷酸序列和氨基酸序列的變異情況，從結(jié)果我們可以看出僅2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異，分別為630和632核苷酸位點(diǎn)，同源性高達(dá)99.6%～100%。從推導(dǎo)的氨基酸序列來(lái)看發(fā)生核苷酸變異的位點(diǎn)氨基酸也發(fā)生改變，雖然只有2個(gè)氨基酸發(fā)生變異,但都是親水性氨基酸殘基，運(yùn)用DNA Star軟件進(jìn)行蛋白分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生變異后該位置的α螺旋和β折疊均發(fā)生變化，氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)的位置由內(nèi)部轉(zhuǎn)到外部，潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇也下降。E0基因作為病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的一個(gè)主要保護(hù)性抗原和防治豬瘟的一種靶蛋白，具有神經(jīng)細(xì)胞毒性和抗凝集活性，與CSFV的致病性和病毒的宿主嗜性有關(guān)，而且E0的RNase活性在病毒復(fù)制及病毒感染的致病機(jī)制有關(guān)聯(lián)。因此，關(guān)于豬瘟病毒石門(mén)珠在ST細(xì)胞中連續(xù)傳代后E0基因的變化應(yīng)進(jìn)行深入的研究。

圖5　不同代次間E0基因氨基酸序列比較

圖6　不同代次間E0基因氨基酸序列同源性比較

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Variation Analysis of E0 Gene of Classical Swine Fever Virus Shimen Strain in Continuously Passed ST Cells

SUN Yong-ke,HU Chao-ying,LIN Ming-xing,LU Xing-ran,YANG Yu-ai

(YunnanAgricultureUniversity，Kunming，Yunnan，650201，China)

Abstract:In order to study genetic variation of classical swine fever virus Shimen strains,the primers of CSFV E0 gene of Shimen strain were designed and synthesized according to the published sequence(AF092448.2). The total RNA of classical swine fever virus Shimen strain continuouly passed in ST cells used as a template,and E0 gene was amplified by RT-PCR every five passages of cultured swine fever virus.E0 nucleotide and amino acid sequences were determined.Variabilities of primary,5,10,15,20 and 25 passage viruses were analyzed by using DNA Star software.The results showed that variation appeared in 630 nucleotide point of 10 passage virus,and 632 nucleotide point of 15 passage virus.By molecular biological methods，this research revealed that the E0 genes of CSFV Shimen strain were genetically stable after passages in the ST cells.

Key words:Classical swine fever virus; continuous passage; ST cell; E0 gene; variation

收稿日期：2015-11-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560704)

作者簡(jiǎn)介：孫永科(1977-)，男，江蘇鹽城人，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類(lèi)號(hào):S852.651

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0013-05