陳　茹， 于曉璐， 高小博， 薛春宜， 宋長緒， 邱　楊， 劉志玲， 王　瑩， 段燕喻

(廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州 510623； 2.廣東省動植物與食品進出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東廣州 510623； 3.中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州 510275；4.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081； 5.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東廣州 510640)

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研究論文

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙重液相基因芯片檢測方法的建立

陳茹1,2， 于曉璐3， 高小博4， 薛春宜3， 宋長緒5， 邱楊1， 劉志玲1,2， 王瑩1,2， 段燕喻1,2

(廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州 510623； 2.廣東省動植物與食品進出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東廣州 510623； 3.中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州 510275；4.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081； 5.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東廣州 510640)

摘要：為了實現(xiàn)快速檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)并同步鑒別高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)，根據(jù)PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV 特有的Nsp2基因區(qū)保守序列設(shè)計特異擴增引物和雜交探針，通過雙重一步法RT-PCR不對稱擴增和雙重微球雜交反應(yīng)，建立了雙重液相基因芯片方法。對12株P(guān)RRSV以及其他12種豬病原體的檢測顯示，該法能特異性檢測12株P(guān)RRSV毒株并準(zhǔn)確鑒別其中7株HP-PRRSV，與其他病原體無交叉反應(yīng)；對PRRSV、HP-PRRSV病毒液的檢測低限均小于每個反應(yīng)0.5 TCID50；其組內(nèi)、組間檢測變異系數(shù)均<10%；檢測55份疑似臨床樣品并與商品化熒光RT-PCR試劑盒比較檢測結(jié)果，符合率達98.2%(54/55)。研究結(jié)果為適應(yīng)臨床快速檢測PRRSV提供了一種新的分子生物學(xué)檢測方法。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；xMAP液相芯片

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種高度傳染性疾病，引起母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙癥狀，以及豬的呼吸道癥狀。該病自20世紀(jì)80年代末期開始流行，曾迅速傳遍全球各主要養(yǎng)豬國家，已成為嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。依據(jù)血清學(xué)試驗及基因序列分析研究可將PRRSV劃分為歐洲型和美洲型兩種基因型。自1991年初中國臺灣報道暴發(fā)該病以來，豬繁殖與呼吸綜合征已在我國大陸普遍存在[1]。2006年我國暴發(fā)“豬高熱癥”，研究表明其主要致病病原是具有高致病性的美洲型PRRSV變異毒株(Highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)[2]。HP-PRRSV相對于經(jīng)典美洲型PRRSV在非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2區(qū)域缺失了多個氨基酸, 是其特有的分子標(biāo)志[3]。HP-PRRSV具有極強的致病性，是近年來對養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的病毒之一。養(yǎng)殖領(lǐng)域為了控制疫情大量使用疫苗，但也帶來了疫苗株毒力返強產(chǎn)生疫苗衍生毒株等問題。

加強檢測PRRSV并區(qū)分HP毒株對于豬場預(yù)防PRRSV急性暴發(fā)、監(jiān)測活疫苗免疫及排放、輔助調(diào)整免疫方案等防控措施具有積極作用，并能為進境種豬實施PRRS檢疫把關(guān)提供技術(shù)支持。在檢測鑒別PRRSV毒株方面國內(nèi)已報道固相基因芯片方法[4]、環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測方法[5]、熒光定量RT-PCR方法[6]等，但未見報道液相基因芯片方法。

液相芯片技術(shù)又稱微球懸浮芯片技術(shù)或靈活的多指標(biāo)集成檢測技術(shù)，是新一代高通量分子檢測技術(shù)平臺，具有高通量、高靈敏度、穩(wěn)定、快速、體系靈活等優(yōu)點[7-8]。近年來國內(nèi)外已有建立液相芯片方法檢測人或動物疫病病原[9-12]或其抗體[13]等的研究報道。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒PRRSV-VR2332株由廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心保藏；PRRSV-JXA1-R株疫苗樣品購自大華農(nóng)生物技術(shù)有限公司；PRRSV-AMERVAC疫苗樣品(歐洲型毒株)購自HIPPA公司；PRRSV-CH1a株由中山大學(xué)動物病毒分子生物學(xué)實驗室提供；PRRSV-CH1R株疫苗樣品購自上海海利生物藥品有限公司；6株P(guān)RRSV分離株核酸(PRRSV-BLC、PRRSV-XF、PRRSV-ZLT-H、PRRSV-QY B8-20、PRRSV-JX、PRRSV-YF)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所提供。

豬瘟病毒兔化弱毒活疫苗為哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)分離株核酸由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所提供；豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV-H株、M6株)、豬布魯菌核酸樣品由廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心保藏；副豬嗜血桿菌病滅活疫苗、豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗、豬萎縮性鼻炎滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗為武漢科前動物生物制品有限公司產(chǎn)品；豬乙型腦炎活疫苗為中牧實業(yè)股份有限產(chǎn)品；豬支原體肺炎活疫苗為吉林正業(yè)生物制品股份有限公司產(chǎn)品；豬肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;猴腎細(xì)胞(Marc-145細(xì)胞、HS2H細(xì)胞)、豬腎細(xì)胞(PK-15細(xì)胞)、豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)樣品由廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心保藏。

1.1.2臨床樣品共收集75份臨床樣品，其中55份疑似臨床樣品采自廣東省內(nèi)多家豬場，包括血樣15份、組織樣品22份及精液樣品18份，均來自疑似患病豬，另有20份經(jīng)PRRSV實時熒光定量RT-PCR檢測(試劑見1.1.3)呈陰性的臨床樣品(包括血樣8份，組織樣品5份，精液樣品7份)，均由本課題組收集保存。

1.1.3主要試劑及設(shè)備病毒DNA/RNA提取試劑盒(貨號#DP315)購自天根生化科技(北京)有限公司；一步法RT-PCR試劑(貨號#81401180)購自英濰捷基(上海)生物有限公司；PRRSV實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒(毒株通用型)購自北京賽維克斯公司；MES(2-(N-嗎啡基)乙磺酸)、5 mol/L TMAC(氯化四甲基胺)、Tween-20(吐溫-20)均購自Sigma公司；EDC(1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二酰亞胺)購自Pierce公司；SAPE(鏈霉親和素)購自英濰捷基(上海)生物有限公司。液相芯片檢測儀(Liquid Chip 200 Reader)購自Qiagen公司；PCR擴增儀(ABI 9902)為美國ABI公司產(chǎn)品；舒適型恒溫混勻儀購自德國Eppendorf公司。

1.2方法

三七互娛大宗折價成交：本周三七互娛（002555）成交1筆大宗交易，共450萬股，合計成交金額4396.5萬元，折價率為12.77%，買方為西南證券安徽分公司，賣方為國元證券南陵青銅路營業(yè)部。

1.2.1核酸提取細(xì)胞增殖病毒液：取接種病毒后細(xì)胞病變達90%以上細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，低速離心去除細(xì)胞碎片，取上清按照病毒核酸提取試劑盒說明書進行核酸提??；干粉狀疫苗：加適量ddH2O溶解，取溶解液采用相同核酸提取試劑盒進行核酸提??；油乳狀疫苗：反復(fù)凍融3次后12 000 r/min離心5 min，取下層清液按照上述試劑盒說明提取核酸；組織樣品：將樣品剪碎并液氮研磨，加入PBS制成勻漿，反復(fù)凍融3次，低速離心取上清液，按照上述試劑盒說明進行核酸提取；血液樣品直接按照試劑盒說明進行核酸提取；新鮮精液及商品化精液樣品：按照文獻方法[14]提取。所提取的核酸置于-20 ℃保存。

1.2.2引物設(shè)計與合成采用Array Designer 4.0 Software軟件設(shè)計擴增引物及雜交探針。PRRSV GP2基因特異的引物及探針序列按照文獻[12]合成；HP-PRRSV特異引物及探針序列以高致病性毒株特有的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2基因序列(即相對于經(jīng)典PRRSV毒株為缺失了多個氨基酸序列后形成的閉合序列，參考標(biāo)準(zhǔn)序列GenBank accession no.: KT198714.1)為模板設(shè)計，上游引物序列：5′-CGCGTAGAACTGTGACAAC-3′，下游引物序列：5′-GAAAGCCTCATATTCCGTCTG-3′，探針：5′-GACGCACCAGGATGAGCC-3′。其中下游引物5′端標(biāo)記生物素基團，探針序列5′端標(biāo)記氨基基團。所有標(biāo)記引物及探針均為HPLC純化，非標(biāo)記引物為PAGE純化，由英濰捷基(上海)生物有限公司合成。

1.2.3微球活化與核酸探針偶聯(lián)取少量微球原液分裝至1.5 mL離心管中，加入600 μL MES(0.1 mol/L，pH 4.5)，15 000 r/min離心10 min棄掉上清；加入3 μL探針(10 μmol/L)、10 μL EDC溶液(10 mg/L)，振蕩混勻后室溫避光搖床溫和振蕩30 min；分別用0.2 g/L的Tween-20溶液、1 g/L SDS溶液、1×TE溶液進行洗滌；最后將微球溶于100 μL 1×TE溶液中，并進行微球計數(shù)。

1.2.4雙重核酸擴增反應(yīng)體系與條件提取的病毒核酸按照以下體系進行RT-PCR反應(yīng)： 2×reaction buffer 25 μL，RT/Platinum (1 units/μL)2 μL，生物素標(biāo)記引物每條0.8 μmol/L，非標(biāo)記引物每條0.1 μmol/L，核酸模板用量5 μL，用ddH2O補至50 μL。擴增反應(yīng)條件：50 ℃ 20 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；72 ℃ 1 min。

1.2.5雙液相雜交與檢測分析取1.5×TMAC溶液將偶聯(lián)微球稀釋為工作液，每個PCR管分裝33 μL，其中含有每種微球1 000個，每個樣品孔加入5 μL PCR產(chǎn)物，12 μL 1×TE(pH 8.0)至總體積50 μL，混合均勻后按以下條件進行雜交反應(yīng)：95 ℃ 5 min， 57 ℃、300 r/min 10 min。雜交結(jié)束后，用1×TMAC 將微球洗滌3次，SAPE報告液用1×TMAC稀釋至6.7 mg/L(150倍稀釋)，每管微球沉淀中加入80 μL 1×TMAC-SAPE報告液，振蕩混勻后置恒溫混勻儀中57 ℃、300 r/min 恒溫孵育10 min。將完成雜交反應(yīng)后的樣品液全部加入液相芯片儀器載板中(預(yù)熱57 ℃)進行讀數(shù)檢測，檢測結(jié)果以中位熒光強度(median fluorescence intensity,MFI)熒光值表示。

1.2.6判定閾值依據(jù)對已知樣品和空白對照樣品的檢測試驗以及統(tǒng)計分析結(jié)果，確定判定閾值如下：規(guī)定試驗組樣品孔所讀取的MFI值與該組空白

對照MFI值之差為MFI凈值，當(dāng)該值與該組空白對照MFI值的比值大于等于2時，判定為陽性，否則判為陰性。

2結(jié)果

2.1特異性試驗結(jié)果

采用雙重液相芯片方法對所收集到的12株P(guān)RRSV分離株或疫苗株樣品(除PRRSV-AMERVAC疫苗為歐洲型PRRSV樣品外，其余11株樣品均屬美洲型)，豬瘟病毒等其他12種常見豬病原體、陰性豬精液提取核酸、豬肉粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取核酸(豬基因組核酸)以及4種細(xì)胞核酸樣品進行檢測。結(jié)果顯示，12株P(guān)RRSV均呈GP2基因檢測陽性，其中7株同時呈現(xiàn)HP-PRRSV 特異Nsp2基因檢測陽性，分別為PRRSV JXA1-R株、PRRSV-BLC、PRRSV-XF、PRRSV-ZLT-H、PRRSV-QY B8-20、PRRSV-JX、PRRSV-YF，均判定為HP-PRRSV毒株。其他13種常見豬病原樣品、豬精液提取核酸、豬基因組核酸、以及細(xì)胞核酸樣品均呈現(xiàn)兩種基因檢測陰性(圖1)。

圖1　雙重液相芯片方法特異性檢測試驗結(jié)果

2.2敏感性試驗結(jié)果

取經(jīng)典PRRSV毒株(PRRSV-VR2332株)、HP-PRRSV毒株(PRRSV-JXA1-R株)純化核酸，測量核酸濃度，并用PCR反應(yīng)用水進行10倍梯度稀釋。采用雙重液相基因芯片方法對上述各稀釋度核酸樣品進行檢測，每個稀釋度均做3次重復(fù)試驗，并計算樣品的檢測終點所對應(yīng)的RNA模板用量。結(jié)果顯示，該方法對PRRSV 基因組核酸中GP2基因的檢測低限達每個反應(yīng)0.25 pg，對HP-PRRSV 基因組核酸中Nsp2基因和GP2基因的檢測低限一致，均為每個反應(yīng)0.60 pg。對上述用于核酸純化的病毒液樣品按常規(guī)進行毒價(TCID50)測定，根據(jù)核酸提取時的樣品用量和檢測反應(yīng)中核酸模板用量來換算各稀釋度樣品對應(yīng)的檢測病毒量，換算結(jié)果顯示，該法對上述兩種毒株的檢測低限均小于每個反應(yīng)0.5 TCID50。

2.3重復(fù)性試驗結(jié)果

采用雙重液相芯片方法對PRRSV(VR 2332株)、HP-PRRSV(JXA1-R株)純化核酸分別進行6組平行檢測試驗(包括雙重擴增和雙重微球雜交檢測)，對2株病毒核酸樣品分別計算其6組試驗測得的陽性MFI值變異系數(shù)(組間變異系數(shù)，Inter assay CV%)；對上述2株病毒核酸樣品的同1管PCR擴增產(chǎn)物分別進行6組平行液相雜交檢測試驗，并分別計算其6組試驗測得的陽性MFI值變異系數(shù)(組內(nèi)變異系數(shù)，Intra-assay CV%)。結(jié)果顯示，該法對兩株病毒核酸樣品對應(yīng)的目標(biāo)基因所測得MFI數(shù)值組內(nèi)變異系數(shù)為2.8%～6.8%，組間變異系數(shù)為3.1%～5.2%(表1)。

2.4臨床樣品檢測結(jié)果

采用上述雙重液相基因芯片方法與PRRSV實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒分別對55份疑似臨床樣品進行檢測，并比較檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，采用雙重液相芯片方法檢出54份陽性，其中52份(占96.3%)呈HP-PRRSV陽性；而采用實時熒光定量RT-PCR方法檢出55份陽性；兩種方法對疑似樣品的檢測符合率達98.2%(54/55)(表2)。

此外，采用雙重液相基因芯片方法對20份經(jīng)實時熒光定量RT-PCR檢測呈陰性的樣品(1.1.2)進行檢測，均呈陰性反應(yīng)。

表1　重復(fù)性試驗結(jié)果

表2　雙重液相芯片方法與實時熒光定量RT-PCR對疑似樣品的檢測結(jié)果

注：“*” 僅GP2基因檢測陽性；“**” GP2和Nsp2 兩種基因檢測陽性。

Note: "*" GP2 gene positive; "*" Positive of GP2 and Nsp2.

3討論

目前國內(nèi)外在檢測或鑒別PRRSV毒株方面已建立多種方法，如常規(guī)或?qū)崟r熒光定量RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫RT-PCR擴增方法、固相基因芯片方法等，但通常適用于檢測美洲型PRRSV，不明確能否適用于檢測歐洲型PRRSV毒株。本研究所采用的方案在設(shè)計引物時充分考慮了對歐洲型毒株的檢測能力，實際檢測結(jié)果證實所建立的雙重液相基因芯片方法能夠覆蓋兩種基因型毒株的檢測，為確保不漏檢PRRSV提供充分技術(shù)保障。

國內(nèi)外已建立的特異性檢測鑒別PRRSV與HP-PRRSV的核酸檢測方法普遍依據(jù)HP-PRRSV相對于經(jīng)典毒株在Nsp2的基因缺失這一分子特征。對于HP-PRRSV毒株，本研究設(shè)計特異性引物與探針時，采用毒株Nsp2基因區(qū)域缺失了30個氨基酸后形成的保守序列為模板設(shè)計。該區(qū)域由對應(yīng)經(jīng)典PRRSV毒株中Nsp2變異區(qū)外側(cè)兩端的基因序列組成，因此，所設(shè)計的特異性探針不能與經(jīng)典毒株的基因組雜交，對其檢測結(jié)果為陰性。根據(jù)對引物和探針序列的BLAST檢索分析結(jié)果，本研究針對HP-PRRSV所設(shè)計篩選的引物和探針能夠特異性識別高致病性毒株，并能覆蓋GenBank 收錄的各種HP-PRRSV分離株序列。

在現(xiàn)有各種核酸檢測方法中，固相基因芯片方法通常由于檢測步驟繁瑣造成背景信號值不穩(wěn)定，試驗重復(fù)性和穩(wěn)定性不理想，并導(dǎo)致檢測敏感性不理想；實時熒光定量PCR方法快速靈敏，但多重?zé)晒舛縋CR方法試劑成本高，且其多重檢測常伴隨檢測敏感性下降問題。而xMAP液相基因芯片技術(shù)整合了多重核酸擴增技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光信號檢測技術(shù)以及自動化數(shù)據(jù)分析技術(shù)，根據(jù)堿基配對原理通過液相環(huán)境中微球偶聯(lián)的DNA探針特異識別待測樣本核酸的目標(biāo)基因序列，并通過自動化檢測雜交信號強度來進行定性和定量分析，確保檢測結(jié)果特異靈敏，并且能夠靈活組合多重反應(yīng)；其對每種目標(biāo)的檢測值取50個～100個目標(biāo)微球的中值，相當(dāng)于每個樣本重復(fù)檢測了50次～100次，有利于保障檢測結(jié)果的穩(wěn)定性；xMAP液相基因芯片技術(shù)還具有操作簡單、快速和樣品消耗量少等優(yōu)點，由于分子雜交是在懸浮溶液中借助微球體進行，大大提高了檢測速度和反應(yīng)效率，并且在同一個反應(yīng)體系中能同步檢測多達100種目標(biāo)。

為確保檢測高效準(zhǔn)確，本研究對反應(yīng)條件進行細(xì)致的優(yōu)化，在探針與微球偶聯(lián)過程中，通過適當(dāng)增加EDC的使用量保證了微球與探針偶聯(lián)效率；在雜交反應(yīng)以及雜交結(jié)束后顯色反應(yīng)階段，采用恒溫渦旋振蕩器在恒溫且恒速溫和振蕩狀態(tài)下進行，使偶聯(lián)微球與PCR產(chǎn)物充分接觸，提高了雜交和顯色反應(yīng)效率；為了降低雜交的背景信號值，在雜交反應(yīng)后，增加了洗滌步驟，即加入1×TMAC雜交液低速離心，洗去引物二聚體、非特異擴增產(chǎn)物等雜質(zhì)，有效降低了檢測背景值。

本研究旨在應(yīng)用液相基因芯片技術(shù)建立快速特異檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒并鑒別高致病性毒株的方法。研究過程對所建立的方法進行了特異性、敏感性、重復(fù)性檢測驗證以及臨床檢測和比對試驗，檢測結(jié)果顯示該法準(zhǔn)確可靠。特異性試驗結(jié)果顯示，雙重液相芯片法特異檢出包括歐洲型毒株在內(nèi)的12株P(guān)RRSV疫苗株及分離株，并準(zhǔn)確鑒別其中的7株高致病性毒株，與其他多種豬病原體和豬基因組核酸、傳代細(xì)胞核酸無交叉反應(yīng)。該法對PRRSV及HP-PRRSV純化核酸的檢測低限分別達0.25 pg和0.60 pg，由于病毒核酸提取過程中會殘留一定量的細(xì)胞核酸，因此該法對于病毒核酸的實際檢測低限應(yīng)低于上述測得的數(shù)值；根據(jù)對所用病毒液的毒價測定與換算結(jié)果，該法對2種毒株的檢測低限均小于每個反應(yīng)0.5 TCID50，能夠滿足臨床檢測要求；此外，臨床檢測與比對試驗結(jié)果顯示，該法與實時熒光定量RT-PCR方法對臨床樣品的檢測結(jié)果基本一致；以上試驗結(jié)果充分說明本研究建立的雙重液相基因芯片法檢測靈敏度高；重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，本研究所建立的液相芯片方法檢測PRRSV及HP-PRRSV的組內(nèi)、組間重復(fù)性變異系數(shù)均小于10%，說明檢測反應(yīng)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

臨床檢測結(jié)果顯示，本方法對PRRSV的檢出率與商品化實時熒光定量RT-PCR試劑盒的基本一致，并能夠同步鑒別HP-PRRSV，而單重實時熒光定量RT-PCR方法無法區(qū)分PRRSV與HP-PRRSV。目前我國豬場廣泛應(yīng)用HP-PRRSV毒株制備弱毒疫苗進行預(yù)防免疫及疫病凈化，本研究建立的雙重液相基因芯片方法雖然不能區(qū)分HP-PRRSV中的野毒與疫苗毒株，但其應(yīng)用于臨床檢測仍具有重要的實用價值，特別是能夠用于快速檢疫未經(jīng)免疫的進口種豬，確保不漏檢；在養(yǎng)殖生產(chǎn)中也可用于協(xié)助監(jiān)測疫苗毒排放情況，有助于及時發(fā)現(xiàn)疫苗毒力返強情況。對于臨床檢測呈HP-PRRSV核酸陽性的豬只是否為野毒感染，仍需結(jié)合豬只個體臨床狀況、豬場免疫情況等多方面因素進行綜合判斷。

綜上所述，本研究建立的雙重液相基因芯片方法實現(xiàn)快速檢測PRRSV并鑒別HP-PRRSV，可在2 h內(nèi)完成對純化核酸樣品的檢測，借助液相芯片技術(shù)平臺實現(xiàn)高通量自動化檢測大量樣品，準(zhǔn)確靈敏并且快速，滿足臨床快速診斷以及進出境動物檢疫快速檢測需求，可用于PRRSV早期及隱性感染的快速檢測鑒定，也可用于對活疫苗免疫的跟蹤監(jiān)測，協(xié)助調(diào)查研究疫苗毒株在動物體內(nèi)的排放情況，有助于及時發(fā)現(xiàn)疫苗衍生毒株。本研究為預(yù)防、診斷和監(jiān)控豬繁殖與呼吸綜合征及進出口活豬檢疫把關(guān)提供了新的技術(shù)手段。

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Development of a Duplex xMAP Assay for Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

CHEN Ru1,2, YU Xiao-lu3, GAO Xiao-bo4, XUE Chun-yi3, SONG Chang-xu5,QIU Yang1, LIU Zhing-ling1,2Wang Ying1,2, DUAN Yan-yu1,2

(1.TechnicalCenter,GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou，Guangdong,510623，China;2.GuangdongKeyLaboratoryofImportandExportTechnicalMeasuresofAnimal,PlantandFood,Guangzhou,Guangdong,510623，China; 3.SchoolofLifeSciences,SunYat-SenUniversity,Guangzhou,Guangdong,510275，China;4.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning,Beijing,100081，China; 5.ResearchInstituteofAnimalHealth,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong,510640，China)

Abstract:A duplex xMAP bead-based assay was developed for rapid detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and differentiation of highly pathogenic strains (HP-PRRSV). The xMAP assay could simultaneously detect two target sequences, including the GP2 envelope protein gene of PRRS and the Nsp2 gene conserved region specific for HP-PRRSV strains. The assay detected 12 PRRSV strains used in this study and identified 7 strains as HP-PRRSV, without cross-reactions with 12 non-target swine pathogens. The lower detection limit of the assay on PRRSV, HP-PRRSV strains was determined as below 0.5 TCID50per reaction, respectively. The inter-assay and intra-assay variances (CV%) were both lower than 10%. The assay was applied to test 55 suspected field samples and compared with a commercialized single-plex real-time RT-PCR method. The detection results of the two methods were 98.2% (54/55) in consistency. The study provided a novel molecular method for rapid diagnosis of PRRSV infection.

Key words:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV); highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV); xMAP LiquiChip

收稿日期：2015-12-04

基金項目：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科研項目(2013IK029)； 廣東省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2012B020305003)

作者簡介：陳茹(1968-)，女，海南?？谌?，研究員，博士，主要從事進出境動物疫病分子生物學(xué)檢測研究與應(yīng)用。

中圖分類號:S852.659.6

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0001-06