琚澤亮，趙桂琴，周向睿

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州　730070)

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燕麥Actin基因片段的克隆及序列分析

琚澤亮，趙桂琴，周向睿

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 克隆與分析燕麥肌動蛋白基因片段.【方法】 根據(jù)其他植物Actin基因的保守序列設計一對簡并性引物，以燕麥葉片總RNA為模板，采用RT-PCR的方法擴增出Actin基因片段并克隆到PUCm-T載體，進而轉化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞.陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后進行測序.【結果】 擴增片段長678 bp，共編碼225個氨基酸；所得序列與GenBank 中注冊的Actin基因序列的同源性均在85%以上，與其他肌動蛋白的氨基酸序列的同源性達93%以上.【結論】 系統(tǒng)進化分析表明，擴增到的燕麥肌動蛋白基因與羊草、長穗偃麥草和黑麥草等植物的肌動蛋白基因親緣關系最為密切.

關鍵詞：燕麥；肌動蛋白；序列分析；系統(tǒng)進化分析

肌動蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一種重要的古老蛋白質.在植物中，以肌動蛋白和微管蛋白為基礎的細胞骨架與質膜相關或橫貫細胞質，參與細胞分裂、分化、細胞內囊泡運輸、細胞壁的生物合成、共生現(xiàn)象、胞吞胞吐作用以及膜的循環(huán)利用等眾多生理過程，對生命體的進化有著深遠的影響[1-3].肌動蛋白細胞骨架網(wǎng)絡緊密地聯(lián)系著其他重要的細胞器，發(fā)揮著不可替代的功能.作為管家基因，Actin在各種組織中表達恒定，是植物重要的內標參照之一，可用來比較來源不同的目的基因表達量的差異，以探明其他基因的表達模式及分子調控機制[4-5].同時，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上具有高度的保守性和同源性，這為研究不同物種之間的親緣關系和分化時間提供了有利條件[6-7].

目前已在許多谷物和牧草中克隆到了Actin基因，如玉米[8]、水稻[9-10]、谷子[11]、大豆[12]、花生[13]、蒙古冰草[14]、紫花苜蓿[15]等；對它的相關研究也在進一步深入，如植物激動蛋白異型體[16]、肌動蛋白基因的功能[17]、肌動蛋白的信號轉導、肌動蛋白聚合解聚機制[18-19]、植物細胞動態(tài)微絲骨架系統(tǒng)[20]等方面.

燕麥(Avenasativa)作為重要糧飼兼用作物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優(yōu)良性狀，是西北高寒牧區(qū)主要的一年生飼料作物；由于其籽實含有較高的蛋白質和脂肪以及水溶性纖維素，燕麥還是一種具有很高營養(yǎng)及保健價值的禾谷類作物.目前，燕麥的分子生物學研究尚處于起步階段，基因組測序工作尚未完成，在對燕麥中很多有價值的基因進行研究時需要有內標參照物.同時，植物肌動蛋白的動力學變化是信號轉導途徑中至關重要的一步反應，來自多種信號轉導途徑的蛋白可通過直接作用于肌動蛋白來改變細胞的組織結構[18,21].這對燕麥眾多生理過程發(fā)生機制的研究有重要價值.但是有關燕麥Actin基因的研究目前尚未見報道.鑒于此，本研究以燕麥幼苗葉片為試驗材料，采用近緣克隆的方法克隆燕麥Actin基因片段，并進行序列分析，與其他高等植物肌動蛋白基因的相似性進行了比較，為燕麥分子生物學的后續(xù)研究打下基礎.

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料為2周齡的‘隴燕3號’幼苗，種子由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院提供.采集新鮮材料的葉片用液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?

1.2試驗試劑

UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、E.coliDH5α菌株、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、MgCl2、Maker 均購自上海生工.其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.

1.3總RNA的提取

現(xiàn)在有一群熱心的家長，他們組成班級家委會，定期為孩子們策劃實踐活動。有的家長發(fā)現(xiàn)孩子缺乏閱讀興趣，就組織閱讀分享會，培養(yǎng)孩子的閱讀興趣。有的家長發(fā)現(xiàn)孩子的好詞好句積累貧乏，就組織了成語接龍大賽，激發(fā)孩子們積累好詞好句的熱情。五年級綜合性學習單元，遇到《遨游漢字王國》，家長們便帶著孩子們走上街頭尋找錯別字，并整理分析，撰寫探究報告。每一場活動對孩子們來說都是一次學習的機遇，家長就是這些機遇的制造者，為孩子們增添許多實踐的機會，使孩子們在實踐中享受學習的樂趣。

參考UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒操作手冊進行總RNA的提取，并根據(jù)實際情況稍作改進.用Gene Spec核酸檢測儀檢測RNA 質量濃度.將所得RNA樣品于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.4引物設計與合成

通過對冰草(GQ457302)、大麥(AY145451)、黑麥草(AY014278)、黑米(AY212324) 、水稻(AY212324)、小麥(AB181991)、羊草(HM623326)等幾種近緣植物肌動蛋白基因的核苷酸序列進行同源性比較分析，依據(jù)同源性高和簡并性低的原則，設計一對簡并引物P1、P2，用于擴增燕麥Actin基因片段，推測目的片段的長度為678 bp.引物由上海生工合成.P1：5′-GCGAATACCATATCTGTWTT-3′；P2：5′-TTCCTCCGAATCTCGACACT-3′；其中W=A、T.

1.5RT-PCR擴增

cDNA 第一鏈的合成按照M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒操作手冊進行.

PCR 擴增反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2 mmol/L)5 μL、MgC12(25 mmol/L)3 μL，TaqDNA polymerase(5U/1 μL) 0.5 μL、P1(10 μmol/L) 1 μL、P2(10 μmol/L) 1 μL、cDNA 4 μL和30.5 μL無菌水，總體積為50 μL.反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.取10 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測目的條帶.

1.6PCR產(chǎn)物的回收、轉化、鑒定與測序

1.7序列的生物信息學分析

使用NCBI在線分析軟件BLAST( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 進行同源性比較；序列的翻譯、分析及系統(tǒng)進化樹的構建等在DNAMAN、MEGA4等生物軟件上進行.

2結果與分析

2.1燕麥總RNA的提取

以燕麥幼嫩葉片為材料提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結果(圖1)顯示，有3條明顯的條帶，28S rRNA的亮度約為18S rRNA的2倍，說明RNA有較好的完整性.Gene Spec核酸檢測儀檢測結果顯示A260/A280、A260/A230值均大于1.8，表明RNA純度較高，可以用于后續(xù)試驗.

圖1　燕麥葉片總RNA的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of total RNAisolated from oat leaves

2.2RT-PCR 擴增

用所得燕麥總RNA為模板進行反轉錄試驗，獲得第一鏈cDNA后，用簡并引物P1、P2進行PCR擴增.對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果可見680 bp處有1條條帶(圖2).該條帶大小與目的片段一致，且上下無雜帶，可能是目的片段，有待進一步鑒定.

2.3陽性克隆的篩選鑒定

將可能為目的基因的片段回收純化，然后與PUCm-T載體連接，轉化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞，用含有50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基進行藍白斑篩選培養(yǎng).從轉化的平板上隨機挑取4個陽性克隆提取質粒，進行PCR擴增，得到的片段大小約為678 bp(圖3)，與RT-PCR結果一致，鑒定為陽性克隆，將其送往上海生工進行測序.

M：Marker ；1-2：PCR產(chǎn)物.圖2　燕麥Actin基因PCR產(chǎn)物Fig.2　PCR product of Actin from oat cDNA

M ：Marker；1-4：為陽性克隆.圖3　陽性克隆的PCR檢測結果Fig.3　PCR identifying of positive clone

2.4測序結果及序列分析

將陽性克隆進行雙向測序，得到一段678 bp的cDNA序列，編碼225個氨基酸(圖4).將該基因片段與GenBank數(shù)據(jù)庫進行核苷酸同源性比較分析，Blast結果顯示：該片段與其他肌動蛋白基因的核酸序列同源性均很高，在85%以上.與小麥(GQ339780)和長穗偃麥草(KF981729)的同源性為最高，達96%.氨基酸分析結果顯示同源性達93%以上.這證明了所得片段即為燕麥肌動蛋白基因片段.將該基因命名為AsACT，同時將序列提交至GenBank，登錄號為KP257585.

根據(jù)GenBank中肌動蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)推測出燕麥Actin基因的氨基酸序列片段，并與GenBank數(shù)據(jù)庫進行氨基酸多重比較.結果顯示其保守氨基酸為201個，非保守氨基酸為24個，表明克隆所得片段為肌動蛋白基因的高度保守區(qū)域，也進一步證實了肌動蛋白是一種高度保守的蛋白.

下劃線為引物序列.圖4　燕麥Actin基因cDNA的核苷酸序列片段與推測的氨基酸序列Fig.4　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Actin from oat

2.5常見作物與牧草肌動蛋白家族系統(tǒng)進化分析

根據(jù)Blast結果，選取我國常見的、同源性較高的作物與牧草，下載它們的肌動蛋白序列，包括羊草(Leymuschinensis，ADK98519)、長穗偃麥草(Lophopyrumelongatum，AHL58686)、黑麥草(Loliumperenne，AAG43040)、水稻(sativaJaponicaGroup，AAO62546)、黑米(sativaJaponicaGroup，AAO62546.1)、玉米(Zeamays，NP 001159156)、冰草(Agropyroncristatum，ACV71031)、大麥(Hordeumvulgare，AAN59956)、小米(Setariaitalica，AAG10041)、花生(Arachishypogaea，ABI79455)、黃豆(Glycinemax，ACU27913)、馬鈴薯(Solanumtuberosum，ACU27904)、豌豆(Pisumsativum，ACU27909)、紫花苜蓿(Medicagosativa，AFB83349)、油菜(Brassicanapus，AAD03741)、蒙古冰草(Agropyronmongolicum，ACL36421)和小麥(Triticumaestivum，BAD23897).用MEGA5.1生物軟件中的ClustalW進行序列比對，然后采用Neighbor-Joining算法構建系統(tǒng)進化樹(圖5)，參數(shù)為默認值.

圖5　常見作物與牧草肌動蛋白的分子進化樹Fig.5　Phylogenetic analysis of Actin proteins

結果表明，燕麥肌動蛋白與羊草、長穗偃麥草和黑麥草的親緣關系最為密切，其次為水稻、玉米等禾本科作物，它們處于同一個分支上.燕麥分為皮燕麥和裸燕麥兩種，本研究采用的‘隴燕3號’為皮燕麥，主要用作飼草，圖5顯示與其親緣關系最為密切的3種植物皆為牧草.同時，圖中還反映出系統(tǒng)分類學上同一科的植物，往往被聚類在一起，親緣關系較近，如豆科的豌豆、紫花苜蓿，禾本科的蒙古冰草和小麥.這些都暗示肌動蛋白基因的進化存在種屬特性，處于同種生態(tài)位的植物其功能基因在進化中往往親緣關系密切.而茄科的馬鈴薯與豆科植物聚為一類，十字花科的油菜與禾本科植物聚為一類，體現(xiàn)了植物肌動蛋白進化的復雜性，這可能與該基因功能的復雜性有關[22].也進一步證明了肌動蛋白的高度保守性，對其完成眾多細胞功能、承受選擇壓力具有重要的生物學意義.

3討論

高等植物肌動蛋白是單一多肽鏈的球狀蛋白，由375～377個氨基酸組成，分子質量為42 ku，廣泛存在于植物的各種組織器官中.與其功能保守性相對應的是其氨基酸序列具有高度的保守性和同源性[10].本研究所得序列與GenBank 中注冊的Actin 基因序列的同源性均在85%以上，與其他肌動蛋白的氨基酸序列的同源性達93%以上，也再次證明了這一點.蛋白質進化速率主要取決于功能上的需要或自然選擇壓力，而較少受氨基酸組成的影響[23].李園莉等[11]在比較了多種植物肌動蛋白基因所編碼的氨基酸變化的位置和分布之后，提出肌動蛋白氨基酸序列有大量更換替代，但是序列的親水、疏水特性有高度的相似性.這反映出肌動蛋白在三級結構上具有強烈的抗選擇壓力，為保障細胞生命活動提供了堅實的結構基礎[6]，也說明了肌動蛋白在植物生命活動中功能的重要性.以植物肌動蛋白為主形成的動態(tài)微絲骨架系統(tǒng)已成為植物細胞生物學研究領域的熱點之一[20].本試驗結果為燕麥肌動蛋白后續(xù)功能研究提供了有力參考，豐富了燕麥細胞骨架領域的研究資料.

燕麥是一種糧草兼用型1年生飼料作物，具有適應性強、產(chǎn)草量高、營養(yǎng)價值高、適口性好、經(jīng)濟效益高等特點[24].但是，燕麥的遺傳背景和分子生物學研究基礎比較差，基因組測序尚未完成，在研究燕麥多種優(yōu)良抗逆基因及其他遺傳特性時需要一個良好的基因作為內參[25].肌動蛋白基因高度的保守性使其成為一種很好的植物基因研究內標之一.本研究選取皮燕麥為材料，克隆到的肌動蛋白基因全長678 bp，序列長度能夠滿足不同長度擴增片段引物設計、不同PCR反應程序的需要，可為燕麥其他基因表達模式及調控機制的研究提供參考；同時，不足之處是未與裸燕麥做比較，進一步的研究正在進行中.

肌動蛋白是從分子水平研究生物系統(tǒng)進化的一個很好的材料.本研究中，常見作物與牧草肌動蛋白家族系統(tǒng)進化分析結果反映了各植物間的親緣關系，使我們能夠了解各種生物進化的進程[11]，研究燕麥的起源與進化，促進作物種質資源的科學利用與管理.由于植物肌動蛋白基因成員組成的廣泛性和分化性，當前已知的肌動蛋白基因僅為植物肌動蛋白家族的一部分，根據(jù)肌動蛋白基因序列構建的系統(tǒng)樹還只是基因的分子進化樹，雖然在區(qū)分親緣關系較遠的物種時具有一定的參考價值，但對親緣關系較近的物種則無法做出精確衡量.完善的物種進化樹有待于今后更多肌動蛋白基因的發(fā)現(xiàn)和系統(tǒng)進化分析方法的改進和完善[26-27].隨著研究的深入，越來越多的植物肌動蛋白基因被克隆出來，對它的研究會更廣泛而深入，進而促進肌動蛋白基因在各種作物研究和改良上的應用，為農業(yè)增產(chǎn)增收提供保障.

4結論

采用RT-PCR的方法進行燕麥Actin基因片段的克隆.獲得了一段長678 bp的燕麥肌動蛋白cDNA序列，編碼225個氨基酸；所得序列與GenBank 中注冊的Actin基因序列的同源性均在85%以上，與其他肌動蛋白的氨基酸序列的同源性達93%以上.系統(tǒng)進化分析顯示其與羊草、長穗偃麥草和黑麥草等植物的肌動蛋白基因親緣關系最為密切.

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(責任編輯趙曉倩)

Cloning and sequence analysis ofActingene fragment fromAvenasativa

JU Ze-liang,ZHAO Gui-qin,ZHOU Xiang-rui

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University，Key Laboratory of Grassland Ecology System,Ministry of Education,Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】To clone and analyze theActingene fromAvenasativa.【Method】 Degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the actin genes from other plants.Total RNA was extracted from the leaves ofA.sativa.Actin gene fragment was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into PUCm-T vector.The positive clone identified by PCR was sequenced.【Result】 The amplified fragment fromA.sativacontains 678 bp,encoded a protein of 225 amino acids.Homology comparison with other plants actin gene sequences in the GenBank showed that it shared over 85% nucleotide sequence homology and 93% amino acid sequence homology with other plants actins.【Conclusion】Actingene ofA.sativahas an intimate genetic relationship withActingenes ofLeymuschinensis,LophopyrumelongatumandLoliumperenne.

Key words：Avenasativa;Actin;sequence analysis;phylogenetic analysis

通信作者：趙桂琴，女，教授，博士生導師，研究方向為草種質資源及育種.E-mail：zhaogq@gsau.edu.cn

基金項目：農業(yè)部牧草種質資源保護項目(2013014)；甘肅高校基本科研業(yè)務費項目(2012009).

收稿日期：2015-03-17；修回日期：2015-04-21

中圖分類號：S 512.6

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)03-0037-06

第一作者：琚澤亮(1991-)，男，碩士，研究方向為草種質資源.E-mail：juzliang@126.com