萬學(xué)瑞，楊潤霞，王 川，劉桂林，吳 潤

?

蛋白激酶CK2抑制劑對雞朊蛋白高表達(dá)和抑制表達(dá)DF－1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

萬學(xué)瑞，楊潤霞，王 川，劉桂林，吳 潤*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070）

摘 要：為探討CK2在雞細(xì)胞型朊蛋白（ChPrPC）高表達(dá)和抑制表達(dá)的DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程中的作用及其與ChPrPC表達(dá)量的關(guān)系，以DF－1－PrP和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞為模型，DF－1細(xì)胞為對照，分別用0、25、50、100nmol·L－1米托蒽醌處理以抑制CK2，檢測細(xì)胞對鼠尾膠原的黏附能力，Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲力，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，RT－PCR法檢測PRNP基因mRNA轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示，DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞的PRNP基因mRNA轉(zhuǎn)錄量隨著米托蒽醌濃度的增加均減少，其增殖、黏附、侵襲能力相應(yīng)下降，而總凋亡率均升高；但在同一米托蒽醌濃度下，DF－1－PrP細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力始終高于DF－1細(xì)胞，總凋亡率均低于DF－1細(xì)胞；DF－1－SiRNA－3細(xì)胞則相反。表明ChPrPC的高表達(dá)可促進(jìn)DF－1細(xì)胞增殖、黏附和侵襲，抑制其凋亡，而ChPrPC的低表達(dá)則相反；CK2在ChPrPC介導(dǎo)DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程中具有重要的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明ChPrPC生理功能的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蛋白激酶2；雞朊蛋白；DF－1細(xì)胞系；米托蒽醌；凋亡

蛋白激酶CK2（casein kinase 2）是一種在真核細(xì)胞中普遍存在和高度保守的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶［1］。目前已發(fā)現(xiàn)其底物多達(dá)300多種，其中絕大多數(shù)與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)有關(guān)，在細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等過程中起著重要的作用［2－4］。米托蒽醌（mitoxantrone）是蒽醌類衍生物的一種，具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學(xué)作用，是較強(qiáng)的蛋白激酶CK2的抑制劑之一［5－6］。

細(xì)胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPC）是由細(xì)胞自身基因編碼的、在真核細(xì)胞膜上的GPI錨定蛋白［7］。哺乳動物細(xì)胞型朊蛋白錯(cuò)誤折疊形成致病型朊蛋白（scrapie prion protein，PrPSC）導(dǎo)致傳染性海綿狀腦病的發(fā)生，目前還未發(fā)現(xiàn)非哺乳動物體患病的病例［8］。多項(xiàng)研究證明哺乳動物細(xì)胞型朊蛋白具有多種生理功能，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、銅離子代謝和氧化應(yīng)激等過程［9－15］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)雞細(xì)胞型朊蛋白（ChPrPC）表達(dá)及分布規(guī)律同哺乳動物PrPC相似［16］，通過構(gòu)建雞細(xì)胞型朊蛋白高表達(dá)的雞成纖維（DF－1）穩(wěn)定細(xì)胞系（DF－1－PrP）證實(shí)其可促進(jìn)DF－1細(xì)胞黏附、增殖和侵襲，抑制其凋亡［17］，抑制表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系（DF－1－SiRNA－3）則相反，但其機(jī)制還不清楚。

牛PrP能和CK2結(jié)合并上調(diào)CK2的磷酸化活性［18］，且重組的牛PrPC還能被CK2磷酸化，位點(diǎn)位于154位的絲氨酸［19］。CK2不僅能在體外和原核表達(dá)的人PrPC相互作用，也能與腦組織內(nèi)源性的PrP相互結(jié)合，推測CK2參與了人PrPC生物學(xué)功能的發(fā)揮［20］，但CK2在ChPrPC生理過程中的作用還未見報(bào)道。本課題組應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)ChPrPC高表達(dá)DF－1－PrP細(xì)胞的CK2基因轉(zhuǎn)錄量明顯高于DF－1細(xì)胞，而抑制表達(dá)DF－1－SiRNA－3細(xì)胞低于DF－1細(xì)胞［21］，推測CK2可能也參與了ChPrPC的生物學(xué)過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與凋亡。為了證實(shí)這一推測，作者利用米托蒽醌抑制CK2的活性，探討其對雞細(xì)胞型朊蛋白高表達(dá)DF－1－PrP細(xì)胞和抑制表達(dá)DF－1－SiRNA－3細(xì)胞黏附、增殖、侵襲和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 DF－1細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所劉光清研究員惠贈；DF－1－PrP細(xì)胞（ChPrPC高表達(dá)DF－1細(xì)胞）和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞（朊蛋白抑制表達(dá)DF－1細(xì)胞）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS，HyClone公司），鼠尾膠原（杭州生友生物技術(shù)有限公司）；DMEM、無血清培養(yǎng)液（GIBCO公司），鹽酸米托蒽醌（Solarbio公司），matrigel基質(zhì)膠（BD公司），噻唑藍(lán)（MTT），Annexin V－FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司），Transwell小室（Costar公司），牛血清白蛋白（BSA，西安依科生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 MyCyclerTMThermal Cycler EN－61010PCR儀（美國BIO－RDA公司），Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；酶標(biāo)儀680（美國BIO－RAD公司），F(xiàn)ACSCalibur flow cytometer（美國BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U·mL－1）和鏈霉素（100μg·mL－1）的DMEM培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞黏附試驗(yàn) 將50mg·L－1鼠尾膠原用6mmol·L－1無菌乙酸溶液按1∶8稀釋，50 μL·孔－1加入96孔培養(yǎng)板，4℃過夜制備基底膜。吸出孔中殘余液體，加入50μL無血清培養(yǎng)液，37℃孵育30min水化基底膜。將對數(shù)生長期的DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105·mL－1，100μL·孔－1分別接種于包被鼠尾膠原的孔中，再加入米托蒽醌使其終濃度分別為0、25、50、100 nmol·L－1，每組4個(gè)重復(fù)，37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，以包被牛血清白蛋白（BSA，10g·L－1）為對照。細(xì)胞培養(yǎng)1h后，用PBS溶液小心的洗細(xì)胞3次，按照MTT比色法測定培養(yǎng)板各孔的光吸收值（A值），試驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用如下公式分別計(jì)算各組細(xì)胞的黏附率：黏附率（%）＝［（處理組A值/BSA對照組A值）－1］×100%。

1.2.3 侵襲試驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠置于4℃冰箱過夜解凍，用預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)液以1∶3將其稀釋，然后吸取50μL，均勻鋪到孔徑為8.0μm的Transwell小室中，37℃放置30min。吸出殘余液體，加入50μL PBS，37℃孵育30min。用0.25%的胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞（1×105·mL－1）。將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在下室中加入500μL完全培養(yǎng)液，在Tanswell小室中加入100μL細(xì)胞懸液，再加入米托蒽醌，使其終濃度分別為0、25、50、100nmol·L－1，每組4個(gè)重復(fù)，37℃、5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)12h。棄培養(yǎng)液，取出Transwell小室用PBS洗2次，擦凈上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，甲醇中固定細(xì)胞15min，倒置，風(fēng)干；加0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗3次，倒置顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)Transwell小室微孔膜外側(cè)10個(gè)視野的細(xì)胞，取平均數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞（1× 105·mL－1），100μL·孔－1接種96孔培養(yǎng)板中，加入米托蒽醌使其終濃度分別為0、25、50、100nmol·L－1，以DMEM培養(yǎng)液為空白對照，每組3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48h后，每孔加入20μL MTT（5mg·mL－1）溶液，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后吸出孔內(nèi)液體，再加入150μL DMSO振蕩10min。用酶標(biāo)儀檢測，讀取OD490nm。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 在對數(shù)生長期的DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞中加入米托蒽醌使其終濃度分別為0、25、50、100 nmol·L－1，作用24h后，消化收集細(xì)胞（5× 105·mL－1），按Annexin V－FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，冷PBS洗細(xì)胞2次，加入200μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入10 μL Annexin V－FITC和5μL PI，輕搖混勻，孵育15 min；上述溶液中加入400μL結(jié)合緩沖液充分混勻，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 不同米托蒽醌濃度下PRNP基因轉(zhuǎn)錄的檢測 在對數(shù)生長期的DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3 和DF－1細(xì)胞中加入米托蒽醌使其終濃度分別為0、25、50、100nmol·L－1，作用24h后，收集細(xì)胞提取總RNA。利用本實(shí)驗(yàn)室建立的雞PrPC基因mRNA熒光定量RT－PCR檢測方法，檢測PRNP基因mRNA轉(zhuǎn)錄量［22］。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件One－Way分析（Anova）或t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05、P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 米托蒽醌以劑量依賴方式抑制細(xì)胞黏附

細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，隨著米托蒽醌濃度的升高，各細(xì)胞的黏附率均極顯著下降（P＜0.01）。在同一米托蒽醌濃度下，DF－1－PrP細(xì)胞黏附率均高于DF－1細(xì)胞，而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞黏附率均低于DF－1細(xì)胞，差異極顯著（P＜0.01）。當(dāng)米托蒽醌濃度為0nmol·L－1時(shí)，各細(xì)胞黏附率均最高，且DF－1－PrP細(xì)胞黏附率比DF－1細(xì)胞高72.69%，而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞黏附率比DF－1細(xì)胞低30.82%；當(dāng)米托蒽醌濃度100nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP、DF－1和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞的黏附率分別被抑制了68.43%、54.65%和66.99%。

表1 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞黏附率的影響(±s）Table 1 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell adhesion rates(±s）　%

表1 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞黏附率的影響(±s）Table 1 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell adhesion rates(±s）　%

在同一列中與DF－1相比，*.P＜0.05，**.P＜0.01，下同In the same column，*.P＜0.05，**.P＜0.01compared with DF－1cells，the same as below

細(xì)胞Cell米托蒽醌濃度/（nmol·L－1）Mitoxantrone concentration 0 　25 　50 　100 DF－1－PrP 　78.11±8.88**　53.04±13.2**　46.59±7.94**　24.66±11.53**DF－1 　45.23±1.55 　39.26±1.02 　32.12±0.39 　20.51±0.18 DF－1－SiRNA－3 　31.29±5.57**　26.82±9.85**　19.73±3.61**　10.33±3.67**

2.2 米托蒽醌以劑量依賴方式抑制細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，米托蒽醌濃度為0nmol·L－1時(shí)，各細(xì)胞的侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)最多，其侵襲力最強(qiáng)，隨著米托蒽醌濃度的升高，細(xì)胞的侵襲力顯著下降（P＜0.05），但同一米托蒽醌濃度下DF－1－PrP細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著多于DF－1細(xì)胞，而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均少于DF－1細(xì)胞，差異極顯著（P＜0.01）（圖1）。

表2 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞侵襲（侵襲細(xì)胞數(shù)）的影響（±s）Table 2 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell invasion（Cell numbers of invasion）（±s）

表2 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞侵襲（侵襲細(xì)胞數(shù)）的影響（±s）Table 2 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell invasion（Cell numbers of invasion）（±s）

細(xì)胞Cell米托蒽醌濃度/（nmol·L－1）Mitoxantrone concentration 0 　25 　50 　100 DF－1－PrP 　176±8**　169±20**　136±13**　65±20**DF－1 　122±12 　116±5 　84±14 　38±10 DF－1－SiRNA－3 　88±8**　76±12**　43±11**　22±3**

圖1 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞侵襲的影響（250×）Fig.1 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell invasion（250×）

2.3 米托蒽醌以劑量和時(shí)間依賴方式抑制細(xì)胞增殖

應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示（圖2），米托蒽醌濃度為0nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP細(xì)胞增殖活性最高，培養(yǎng)48h時(shí)細(xì)胞的相對數(shù)量是DF－1細(xì)胞的234.94%，而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞的相對數(shù)量是DF－1細(xì)胞的66.27%，差異極顯著（P＜0.01）。隨著米托蒽醌濃度的增加和作用時(shí)間的延長，增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。當(dāng)米托蒽醌濃度為25nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP、DF－1和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞培養(yǎng)48h時(shí)的相對細(xì)胞數(shù)量比其0nmol·L－1時(shí)的分別減少了60.43%、58.33%和36.14%，當(dāng)米托蒽醌濃度為100nmol·L－1時(shí)，則分別減少了74.23%、73.90% 和52.83%，差異顯著（P＜0.05）。

圖2 不同米托蒽醌濃度對細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell proliferation

2.4 米托蒽醌以劑量依賴方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞經(jīng)Annexin－V－FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示（圖3、表3），在米托蒽醌濃度為0 nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP細(xì)胞總凋亡率低于DF－1細(xì)胞，而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞高于DF－1細(xì)胞，差異極顯著（P＜0.01）。隨著米托蒽醌濃度的增加，各細(xì)胞的總凋亡率均升高，而且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)米托蒽醌濃度為25nmol·L－1時(shí)，對DF－ 1－PrP細(xì)胞的凋亡率無明顯影響，而對DF－1－SiRNA－3細(xì)胞的凋亡率影響極大，對DF－1細(xì)胞的凋亡率影響居中；當(dāng)米托蒽醌濃度為大于50nmol·L－1時(shí)，對DF－1－PrP細(xì)胞的凋亡率影響顯著增加，當(dāng)米托蒽醌濃度為100nmol·L－1時(shí)，其細(xì)胞總凋亡率為19.92%，而DF－1和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞分別為45.87%和81.62%，差異極顯著（P＜0.01）。

表3 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞總凋亡率的影響Table 3 Effects of different concentration of mitoxantrone on total cell apoptosis rates　%

2.5 不同米托蒽醌濃度下PRNP基因的轉(zhuǎn)錄量分析

利用本實(shí)驗(yàn)室建立的雞PRNP基因mRNA實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測方法，檢測DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞PRNP基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量，結(jié)果顯示（表4），加入米托蒽醌時(shí)各細(xì)胞PRNP基因的mRNA拷貝數(shù)均出現(xiàn)變化；隨著米托蒽醌濃度的增加，PRNP基因的mRNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)出下降的趨勢，當(dāng)米托蒽醌濃度為100 nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP、DF－1和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞的PRNP基因mRNA拷貝數(shù)分別比其0 nmol·L－1時(shí)減少52.03%、68.21%和46.78%。在同一米托蒽醌濃度下，DF－1－PrP細(xì)胞PRNP基因的mRNA拷貝數(shù)均高于DF－1細(xì)胞，差異極顯著（P＜0.01），而DF－1－SiRNA－3均顯著低于DF－1細(xì)胞（P＜0.05）。

圖3 不同濃度米托蒽醌對細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of different concentration of mitoxantrone on cell apoptosis

表4 不同濃度米托蒽醌對PRNP基因mRNA拷貝數(shù)的影響（±s）Table 4 Effects of different concentration of mitoxantrone on mRNA copy number of PRNP（±s）

表4 不同濃度米托蒽醌對PRNP基因mRNA拷貝數(shù)的影響（±s）Table 4 Effects of different concentration of mitoxantrone on mRNA copy number of PRNP（±s）

細(xì)胞Cell米托蒽醌濃度/（nmol·L－1）Mitoxantrone concentration 0 　25 　50 　100 DF－1－PrP 　91 226.12±64.16**78 351.56±331.25**65 228.94±109.11**43 762.77±228.72**DF－1 　22 955.25±93.59 16 438.18±178.05 　9 663.27±98.79 　7 298.54±116.44 DF－1－SiRNA－3 　10 676.82±95.43*8 455.31±135.38*6 552.39±231.48*　5 682.15±75.12*

3 討 論

CK2在多種白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞中活性比相應(yīng)的正常組織中高2～8倍，且CK2的變化與腫瘤的生長情況相關(guān)［23］。CK2可被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的抑制劑，因此抑制CK2的活性即可抗腫瘤及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［24］，另外，CK2在細(xì)胞生長、增殖、分化等過程中起著重要的作用。但CK2在ChPrPC生理過程中的作用還未見報(bào)道，為此作者以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ChPrPC高表達(dá)和抑制表達(dá)的雞成纖維穩(wěn)定細(xì)胞系DF－1－PrP和DF－1－SiRNA－3為細(xì)胞模型，應(yīng)用CK2抑制劑米托蒽醌抑制其活性，探討其對ChPrPC介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)米托蒽醌濃度為0nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力高于DF－1細(xì)胞，總凋亡率卻低于DF－1細(xì)胞，差異極顯著（P＜0.01），而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞則相反，說明ChPrPC具有促進(jìn)DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲，抑制其凋亡的作用，這和PrPC在哺乳動物中的功能相似［12］。而且當(dāng)米托蒽醌濃度為0nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲能力均最高，總凋亡率均最低；隨著米托蒽醌濃度的增加，DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力相應(yīng)下降，而總凋亡率均升高，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；但在同一米托蒽醌濃度下，DF－1－PrP細(xì)胞增殖、黏附、侵襲能力始終高于DF－1細(xì)胞，總凋亡率低于DF－1細(xì)胞，而DF－1－SiRNA－3細(xì)胞則相反，表明CK2亦具有促進(jìn)DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲，抑制其凋亡的作用，且CK2的活性與ChPrPC表達(dá)量正相關(guān)，其在ChPrPC介導(dǎo)DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程中具有重要的作用。這和文獻(xiàn)報(bào)道一致，CK2參與了人PrP生物學(xué)功能的發(fā)揮［20］，牛PrP能上調(diào)CK2的磷酸化活性［18］，但其具體的作用機(jī)制還在進(jìn)一步的研究中。

在增殖試驗(yàn)中，當(dāng)米托蒽醌濃度為100nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP、DF－1和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)的相對細(xì)胞數(shù)量比其0nmol·L－1時(shí)的分別減少了74.23%、73.90%和52.83%，表明ChPrPC高表達(dá)時(shí)，CK2活性的降低對細(xì)胞增殖的抑制作用較ChPrPC抑制表達(dá)時(shí)明顯。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞增殖被抑制的主要原因，在細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中，當(dāng)米托蒽醌濃度為100nmol·L－1時(shí)，DF－1－PrP細(xì)胞總凋亡率比托蒽醌濃度為0nmol·L－1時(shí)增加了18.90%，而DF－1和DF－1－SiRNA－3細(xì)胞分別增加了34.32%和69.81%，可見，ChPrPC高表達(dá)時(shí)，CK2活性的降低對細(xì)胞總凋亡率的影響較小。以上結(jié)果表明，通過米托蒽醌抑制CK2活性引起的DF－1細(xì)胞增殖被抑制不完全是因?yàn)槠浯龠M(jìn)了細(xì)胞凋亡而引起的。

隨著米托蒽醌濃度的增加，DF－1－PrP、DF－1－SiRNA－3和DF－1細(xì)胞中PRNP基因mRNA表達(dá)量均減少，而在同一米托蒽醌濃度下，DF－1－PrP細(xì)胞中PRNP基因mRNA表達(dá)量均高于DF－1－SiRNA－3細(xì)胞和DF－1細(xì)胞，表明CK2表達(dá)量與PRNP基因表達(dá)量相關(guān)聯(lián)，CK2對PrPC可能存在反饋調(diào)節(jié)，但其機(jī)制尚不明確。

總之，ChPrPC的高表達(dá)可促進(jìn)DF－1細(xì)胞增殖、黏附和侵襲，抑制其凋亡，而其低表達(dá)則相反；CK2在ChPrPC介導(dǎo)DF－1細(xì)胞增殖、黏附、侵襲和凋亡過程中具有重要的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明ChPrPC生理功能的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ SVENNINGSSON P，NISHI A，F(xiàn)ISONE G，et al.

DARPP－32：an integrator of neurotransmission［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2004，44：269－296.

［2］ MEGGIO F，PINNA L A.One－thousand－and－one substrates of protein kinase CK2［J］.FASEB J，2003，17 （3）：349－368.

［3］ ZHANG S，LONG H，YANG Y L，et al.Inhibition of CK2αdown－regulates Notch1signalling in lung cancer cells［J］.J Cell Mol Med，2013，17（7）：854－862.

［4］ ZHENG Y，MCFARLAND B C，DRYGIN D，et al.Targeting protein kinase CK2suppresses prosurvival signaling pathways and growth of glioblastoma［J］.Clin Cancer Res，2013，19（23）：6484－6494.

［5］ 李春梅，劉新光，林小聰，等.米托蒽醌對人蛋白激酶CK2活性的影響［J］.癌癥，2008，27（8）：809－815.LI C M，LIU X G，LIN X C，et al.Effects of mitoxantrone on the activity of human protein kinase CK2 holoenzyme［J］.Chinese Journal of Cancer，2008，27 （8）：809－815.（in Chinese）

［6］ 林小聰，李春梅，劉新光，等.9種蒽醌類衍生物對重組人蛋白激酶CK2活性的影響及構(gòu)效淺析［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（6）：733－737.LIN X C，LI C M，LIU X G，et al.Effect and structure－activity study of nine kinds of anthraquinone derivatives on recombinant human protein kinase CK2 holoenzyme［J］.Chinese Phamacological Bulletin，2007，23（6）：733－737.（in Chinese）

［7］ PRUSINER S B.Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie［J］.Science，1982，216（4542）：136－144.

［8］ JI H F，ZHANG H Y.A comparative molecular dynamics study on thermostability of human and chicken prion proteins［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359（3）：790－794.

［9］ BROWN D R，CLIVE C，HASWELL S J.Antioxidant activity related to copper binding of native prion protein［J］.J Neurochem，2001，76（1）：69－76.

［10］ RACHIDI W，MANGéA，SENATOR A，et al.Prion infection impairs copper binding of cultured cells［J］.J Biol Chem，2003，278（17）：14595－14598.

［11］ PAN Y，ZHAO L，LIANG J，et al.Cellular prion protein promotes invasion and metastasis of gastric cancer［J］.FASEB J，2006，20（11）：1886－1888.

［12］ MEHRPOUR M，CODOGNO P.Prion protein：From physiology to cancer biology［J］.Cancer Lett，2010，290（1）：1－23.

［13］ DIARRA－MEHRPOUR M，ARRABAL S，JALIL A，et al.Prion protein prevents human breast carcinoma cell line from tumor necrosis factorα－induced cell death［J］.Cancer Res，2004，64（2）：719－727.

［14］ ROUCOU X，GIANNOPOULOS P N，ZHANG Y，et al.Cellular prion protein inhibits proapoptotic Bax conformational change in human neurons and in breast carcinoma MCF－7cells［J］.Cell Death Differ，2005，12（7）：783－795.

［15］ KIM B H，LEE H G，CHOI J K，et al.The cellular prion protein（PrPC）prevents apoptotic neuronal cell death and mitochondrial dysfunction induced by serum deprivation［J］.Brain Res Mol Brain Res，2004，124 （1）：40－50.

［16］ DIAO X L，WU R，LIU L，et al.Expression patterns of PrP gene during chicken embryo development［J］.Asian J Anim Vet Adv，2012，7（2）：199－204.

［17］ 刁小龍.雞朊蛋白參與DF－1細(xì)胞增殖粘附的功能研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.DIAO X L.The function research of ChPrPCinvolved in the processes of DF－1cells proliferation and adhesion［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2012.（in Chinese）

［18］ MEGGIO F，NEGRO A，SARNO S，et al.Bovine prion protein as a modulator of protein kinase CK2［J］.Biochem J，2000，352（Pt 1）：191－196.

［19］ NEGRO A，MEGGIO F，BERTOLI A，et al.Susceptibility of the prion protein to enzymic phosphorylation ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，271（2）：337－341.

［20］ CHEN J M，GAO C，SHI Q，et al.Casein kinase II interacts with prion protein in vitro and forms complex with native prion protein in vivo［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2008，40（12）：1039－1047.

［21］ 楊潤霞.雞朊蛋白對DF－1細(xì)胞活性及凋亡通路Wnt/β－catenin的影響［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.YANG R X.Impact of chicken prion protein on the viability of DF－1cell and the apoptosis－related pathway Wnt/β－catenin［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2015.（in Chinese）

［22］ 朱曼玲，吳 潤，于宏偉，等.雞Akt基因mRNA SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44（7）：758－764.ZHU M L，WU R，YU H W，et al.Establishment of SYBR GreenⅠreal－time RT－PCR for detection of chicken Akt gene mRNA［J］.Chinese Veterinary Science，2014，44（7）：758－764.（in Chinese）

［23］ XU X，LANDESMAN－BOLLAG E，CHANNAVAJHALA P L，et al.Murine protein kinase CK2：gene and oncogene［J］.Mol Cell Biochem，1999，191（1－2）：65－74.

［24］ GUO C，YU S，DAVIS A T，et al.A potential role of nuclear matrix－associated protein kinase CK2in protection against drug－induced apoptosis in cancer cells ［J］.J Biol Chem，2001，276（8）：5992－5999.

（編輯 白永平）

Effects of CK2Inhibitor on Biological Behaviour of DF－1Cells with High Expression and Suppression Expression of Chicken PrPC

WAN Xue－rui，YANG Run－xia，WANG Chuan，LIU Gui－lin，WU Run*
（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou730070，China）

Abstract：In order to detect the effect of CK2on DF－1cells proliferation，adhesion，invasion and apoptosis based on the higher and lower ChPrPCexpression and its relationship，DF－1cells with higher expression of chicken PrPC（DF－1－PrP），DF－1cells with suppression expression of chicken PrPC（DF－1－SiRNA－3）and DF－1cells were used as cell models，after they were treated with 0，25，50，100nmol·L－1mitoxantrone，adhesion assay，transwell assay，MTT assay，flow cytometric assay and RT－PCR analyses were used to detect cell adhesion，invasion，proliferation，apoptosis and transcription of PRNPmRNA，respectively.The data showed that the expression of PRNPmRNA of DF－1－PrP，DF－1－SiRNA－3and DF－1cells were all decreased with the increasing of mitoxantrone concentration，and adhesion，invasion and proliferation ability were reduced，but apoptosis rate were increased.Furthermore，under the same mitoxantrone concentration，adhesion，invasion and proliferation ability of DF－1－PrP cells was higher than DF－1cells，apoptosis rate was lower，but which of DF－1－SiRNA－3cells was opposite.Results indicated that higher expression of ChPrPCpromoted DF－1cells adhesion，invasion and proliferation and inhibited apoptosis，but suppression expression of ChPrPCwas opposite，CK2plays an important role in those processes.Dataof this study lay the foundation for further clarify the molecular mechanism of ChPrPCphysiological function.

Key words：casein kinase 2；chicken PrPC；DF－1cells；mitoxantrone；apoptosis

中圖分類號：S831.1；S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0985－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.016

收稿日期：2015－09－10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31160510）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院教研產(chǎn)學(xué)支持計(jì)劃（JYCX－KX009）

作者簡介：萬學(xué)瑞（1979－），女，甘肅白銀人，講師，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究工作，E－mail：383921499@qq.com

*通信作者：吳 潤，男，教授，博士生導(dǎo)師，E－mail：wurun@gsau.edu.cn