張亞玲，許冬梅，杜 斌，謝建山，范瑞文，于秀菊，朱芷葳，董常生*

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過表達(dá)miR－193b對黑色素細(xì)胞中MITF 和TYR表達(dá)的影響

張亞玲1，許冬梅2，杜 斌1，謝建山1，范瑞文1，于秀菊1，朱芷葳2，董常生1*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷030801）

摘 要：旨在探討miR－193b對黑色素生成關(guān)鍵基因MITF和TYR表達(dá)的影響，進(jìn)而說明miR－193b對黑色素形成的影響。本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，在綿羊黑色素細(xì)胞中過表達(dá)miR－193b，檢測黑色素細(xì)胞中黑色素含量的變化，采用實時熒光定量PCR和Western blot分別對轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MITF和TYR mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：過表達(dá)miR－193b的黑色素細(xì)胞，黑色素含量明顯減少；MITFmRNA和TYRmRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），分別降低0.233倍和0.198倍；MITF和TYR蛋白表達(dá)量也顯著降低（P＜0.01），分別降低0.232倍和0.321倍。本研究表明，過表達(dá)miR－193b使黑色素細(xì)胞中MITF和TYR表達(dá)量降低而間接影響黑色素生成。

關(guān)鍵詞：miR－193b；MITF；TYR；黑色素細(xì)胞

毛色是哺乳動物重要的外貌特征，也是品種的重要標(biāo)志和重要的經(jīng)濟(jì)性狀。動物毛色表型的實現(xiàn)主要是由體內(nèi)不同黑色素的分布及其相對數(shù)量決定的。當(dāng)黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑素體，被轉(zhuǎn)移并沉積在角化細(xì)胞，就形成肉眼可見的毛色［1］。黑色素有兩種主要類型：褐黑素和真黑素，兩者數(shù)目、大小、組成和分布的變化會影響皮膚色素沉著，而二者的比例決定著哺乳動物的毛色和皮色［2］，而黑色素的形成、轉(zhuǎn)移和沉積由眾多基因調(diào)控。前人研究表明黑色素的形成是由酪氨酸和苯丙氨酸經(jīng)過一系列氨化酶的催化作用而形成的［34］，其中的酪氨酸酶（TYR）是催化酪氨酸進(jìn)一步反應(yīng)的氧化酶，所以TYR是調(diào)節(jié)黑色素合成的關(guān)鍵酶。而TYR的活性和表達(dá)量由相關(guān)基因調(diào)控，其中起到重要調(diào)控作用的基因之一是小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalamia－associated transcription factor，MITF），MITF通過與酪氨酸酶啟動子區(qū)域結(jié)合而調(diào)控TYR以及酪氨酸相關(guān)蛋白的表達(dá)［5］。所以，在研究黑色素生成過程中，TYR和MITF是參與毛色形成，起到重要調(diào)控作用的兩個關(guān)鍵基因。

miRNA是一類由19～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子，它可以通過與靶基因mRNA的3′－UTR退火結(jié)合以達(dá)到對靶基因mRNA的降解或阻礙其翻譯的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［6］。近幾年發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種哺乳動物皮膚中均有表達(dá)，并參與這些動物的皮膚形態(tài)發(fā)生及毛囊的發(fā)育過程［7］。例如，miRNA－203被發(fā)現(xiàn)對表皮分化有重要影響。Z.Zhu等［8］利用基因芯片技術(shù)，構(gòu)建了不同毛色的羊駝皮膚miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)數(shù)個在不同毛色差異表達(dá)的miRNA，并確定miR－25通過調(diào)控MITF的表達(dá)參與毛色形成過程。C.S.Dong等［9］通過對miR－137和靶基因MITF的研究，并成功建立miR－137轉(zhuǎn)基因小鼠模型，確定miR－137參與對毛色的調(diào)控。X.Tian等［10］運用深度測序技術(shù)對不同毛色羊駝進(jìn)行miRNAs的比對，發(fā)現(xiàn)存在48個差異表達(dá)的miRNAs，猜測其可能參與毛色調(diào)控，其中差異表達(dá)較顯著的miRNAs有miR－27a、miR－202和miR－193b等。X.N.Gao等［11］研究結(jié)果表明，miR－193b可以調(diào)控c－kit基因的表達(dá)；黑色素生成的通路圖提示c－kit是參與黑色素生成過程的重要基因，同時，通過Target Scan軟件預(yù)測到c－kit為miR－193b的靶基因，提示miR－193b很可能通過調(diào)控c－kit基因的表達(dá)從而參與調(diào)節(jié)毛色的生成，而黑色素生成過程中，TYR和MITF是參與毛色形成，起到重要調(diào)控作用的兩個關(guān)鍵基因。筆者推測miR－193b對參與毛色生成的重要基因MITF和TYR的表達(dá)有一定影響，最終選擇miR－193b進(jìn)行研究。通過在綿羊黑色素細(xì)胞水平上過表達(dá)miR－193b，以探究miR－193b過表達(dá)對黑色素細(xì)胞中TYR和MITF基因的表達(dá)是否有影響以及有何影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體的獲得及引物合成 真核表達(dá)載體為pcDNA6.2－GW/EmGFPmiR（Invitrogen），綿羊黑色素細(xì)胞系本實驗室保存，引物由北京六合華大科技股份有限公司合成。

1.1.2 試劑 Trizol（Invitrogen，美國）；壯觀霉素；轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，美國）；質(zhì)粒中提試劑盒（QIAGEN，美國）；SYBR Prime Script TMRT PCR KIT（TAKARA公司）；總蛋白提取試劑盒（碧云天）；MITF（Mouse Monoclonal Antibody，Thermo）；TYR（Rabbit polyclonal antibody，Thermo）；HRP標(biāo)記的二抗（抗兔，抗鼠，武漢博士德）；蛋白marker（Thermo，美國），ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京康為公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊黑色素細(xì)胞的復(fù)蘇 黑色素細(xì)胞系本實驗室保存。將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃預(yù)熱的水浴鍋，在1～2min內(nèi)使凍存細(xì)胞完全溶解。4℃1 000r·min－1離心10min，棄上清，用新的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將得到的細(xì)胞懸液均勻的接種于6孔板的6個孔中，置于37℃，CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞板80%左右可進(jìn)行傳代。

1.2.2 黑色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 待6孔板中的黑色素細(xì)胞濃度長到75%左右，按照轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，配制不含雙抗的轉(zhuǎn)染用細(xì)胞培養(yǎng)基，經(jīng)多次試驗顯示在6孔板3μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果最好，因此選其為試驗濃度。把3μg的DNA加入250μL培養(yǎng)基混勻孵育5min，抽6μL DNA－fectin試劑于250μL培養(yǎng)基中混勻后，把兩者混合并孵育20min。移去細(xì)胞中的培養(yǎng)基，每孔添加1 mL的不含雙抗的培養(yǎng)基，并將含有DNAfectin與DNA復(fù)合物的混合培養(yǎng)基均勻接種于6孔板的6個孔，輕輕晃動混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，用完全培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)36h左右后，收其樣品。

1.2.3 細(xì)胞黑色素含量測定 移去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。用0.2 mol·L－1NaOH將細(xì)胞在80℃金屬浴溶解，將黑色素細(xì)胞樣品加入酶標(biāo)板，每個樣品3個重復(fù)，使用分光光度計在475nm波長進(jìn)行測值，分析數(shù)據(jù)，計算黑色素含量變化。

1.2.4 Real－time RT－PCR檢測 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞72h后，利用Trizol法提取黑色素細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）的說明書進(jìn)行cDNA的合成，利用NCBI設(shè)計羊MITF和TYR的引物，引物序列見表1。按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行Real－time RT－PCR試驗，由熔解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線的CT值計算定量結(jié)果，檢測MITF和TYR表達(dá)量。

△CT（試驗組）＝CT（目的基因）－CT（內(nèi)參基因），△CT（對照組）＝CT（目的基因）－CT（內(nèi)參基因），△△CT＝△CT（試驗組）－△CT（對照組），目的基因的相對表達(dá)水平＝2－△△CT。

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行處理，實時熒光定量PCR結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）”表示，其中各基因的表達(dá)量結(jié)果需經(jīng)內(nèi)參基因β－actin表達(dá)量的校正，全部數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗。

表1 目的基因熒光定量引物序列Table 1 RT－PCR primer sequences of target genes

1.2.5 Western blot檢測 按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白，測定其濃度后上樣，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，再轉(zhuǎn)到NC膜上，將NC膜用5%的脫脂奶粉封閉1h，并用一抗在4℃孵育過夜（MITF和TYR均稀釋為1∶500）。第2天早上取出膜，用TBST洗膜10min×3次，放入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2 000）在37℃搖床上孵育1h，再次用TBST洗膜10min×3次。最后用ECL發(fā)光試劑盒顯色后置于暗室曝光，獲得有條帶的膠片保存，分析掃描。利用Image－ProPlus 6.0軟件對黑色素細(xì)胞蛋白MITF、TYR和β－actin免疫印跡結(jié)果分析，測定目標(biāo)條帶面積和灰度值，進(jìn)行半定量分析。數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SE）”表示，用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR－193b生物信息學(xué)分析和篩選

通過Target Scan軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)基因c－kit和miR－193b存在靶向關(guān)系，并結(jié)合前人研究，提示miR－193b通過調(diào)控c－kit基因參與毛色調(diào)控。經(jīng)典的白色基因座編碼的c－kit受體屬于酪氨酸激酶受體家族成員［12］。Kit基因編碼肥大干細(xì)胞生長因子受體與黑色素的生物合成密切相關(guān)［13］，對黑色素細(xì)胞的形成、成熟及增殖遷移有重要作用。

2.2 黑色素細(xì)胞的生長狀態(tài)觀察

正常細(xì)胞接種12h后，即可見黑色素細(xì)胞貼壁伸展，第2天細(xì)胞密度增大，生長狀態(tài)良好，無細(xì)胞污染，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)長梭形（圖1）。

2.3 miR－193b在黑色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

2.3.1 黑色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果觀察 試驗分黑色素細(xì)胞陰性對照組（Negative Control，NC組）和轉(zhuǎn)染miR－193b真核表達(dá)載體組（試驗組），在細(xì)胞密度達(dá)到75%即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR－193b真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入黑色素細(xì)胞56～72h，由于載體上連接了1個啟動報告基因綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在熒光顯微鏡藍(lán)光的激發(fā)下可看到細(xì)胞呈綠色熒光，可以觀察到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞生長良好，細(xì)胞形態(tài)單一，而且轉(zhuǎn)染效率較好，未見其他細(xì)胞污染（圖2）。

圖1 正常的黑色素細(xì)胞Fig.1 Normal melanocytes

圖2 miR－193b轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞的效率Fig.2 The efficiency of transfecting melanocytes by miR－193b

2.3.2 轉(zhuǎn)染后黑色素含量測定 收集轉(zhuǎn)染后的試驗組和NC組細(xì)胞，分別進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并用分光光度計測定475nm處吸光值，分析統(tǒng)計試驗組和NC組的黑色素相對含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR－193b真核表達(dá)載體的黑色素細(xì)胞的黑色素含量明顯降低（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染miR－193b和NC后黑色素細(xì)胞中黑色素含量Fig.3 Melanin content in melanocytes transfected withmiR－193band negative control

2.3.3 Real－time RT－PCR檢測miR－193b，MITF 和TYR在mRNA水平的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染后，分別提取試驗組和NC組的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別對miR－193b、MITF和TYR進(jìn)行Real－time RT－PCR檢測，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR－193b后，miR－193b的表達(dá)量明顯上調(diào)為NC組的10.01倍，MITF基因的mRNA表達(dá)量顯著降低為NC組的0.233倍，TYR基因的mRNA表達(dá)量顯著降低為NC組的0.198倍（圖4）。結(jié)果表明：在黑色素細(xì)胞中過表達(dá)miR－193b會使基因MITF和TYR的mRNA表達(dá)量降低且差異均極顯著（P＜0.01），從而說明過表達(dá)miR－193b會影響黑色素生成。

2.3.4 Western blot檢測MITF和TYR蛋白表達(dá)量 轉(zhuǎn)染后分別提取試驗組和NC組的總蛋白，按500ng上樣量進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，曝光，掃描分析后的蛋白條帶用ImageJ軟件分析，結(jié)果顯示：與NC組相比，MITF和TYR的蛋白表達(dá)量均顯著降低，MITF降低為0.232倍，TYR降低為0.321倍（圖5）。結(jié)果表明：在黑色素細(xì)胞中過表達(dá)miR－193b會使基因MITF和TYR的蛋白表達(dá)量降低，且差異均極顯著（P＜0.01），從而說明過表達(dá)miR－193b會影響黑色素生成。

圖4 轉(zhuǎn)染miR－193b和NC的黑色素細(xì)胞中miR－193b、MITF和TYR在mRNA表達(dá)水平檢測Fig.4 Expression analysis of miR－193b，MITF，TYRin melanocytes transfected with miR－193band negative control

圖5 轉(zhuǎn)染miR－193b和NC的黑色素細(xì)胞中MITF和TYR在蛋白水平檢測Fig.5 Western blotting analysis of MITF，TYR in melanocytes transfected with miR－193band negative control

3 討 論

本試驗利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR－193b轉(zhuǎn)染入黑色素細(xì)胞，以及miR－193b在黑色素細(xì)胞中對黑色素的生成的影響進(jìn)行研究。通過對黑色素細(xì)胞中黑色素含量進(jìn)行提取測定，同時經(jīng)qRT－PCR方法對黑色素細(xì)胞中的miR－193b、MITF和TYR在mRNA水平進(jìn)行檢測，經(jīng)Western bolt方法對黑色素細(xì)胞中的MITF和TYR在蛋白水平檢測，結(jié)果顯示：過表達(dá)miR－193b使MITF和TYR在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上都顯著降低，通過影響MITF和TYR這兩個在黑色素生成路徑上有重要作用的基因的表達(dá)，從而降低黑色素細(xì)胞合成黑色素的含量。這個結(jié)果提示，miR－193b很可能影響動物毛色表型的變化并對毛色進(jìn)行調(diào)控。

miR－193b在眾多癌癥的發(fā)生過程中均有抑制作用，如鄭穎［14］發(fā)現(xiàn)miR－193b是宮頸癌細(xì)胞的一個腫瘤抑制因子，通過下調(diào)Mcl－1來發(fā)揮抑制作用；有研究表明，不同毛色羊駝皮膚miR－193b可能通過調(diào)控靶基因Kit來參與毛色形成；而Kit基因編碼肥大干細(xì)胞生長因子受體（mast/stem cell growth factor receptor，c－kit）在特定的細(xì)胞中表達(dá)，對黑色素細(xì)胞的形成、成熟及增殖遷移有重要作用。哺乳動物的顯性白毛色、小鼠的顯性白點（W）突變和人的花斑性狀（PBT）均由Kit位點調(diào)控［15－16］。同源的Kit基因突變在豬及禽類都表現(xiàn)為顯性的白色斑點。

黑色素的生成是一個復(fù)雜的多因素共同調(diào)控的生理機(jī)制，其中有眾多相關(guān)的調(diào)控基因，而Kit基因是與黑色素細(xì)胞生成環(huán)節(jié)相關(guān)的基因之一。目前研究得比較清楚的調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞增殖分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一有MAPK級聯(lián)途徑［17］，其中c－kit配體為“青灰細(xì)胞生長因子（Steel cell growth factor，SCF），兩者結(jié)合后通過Ras蛋白作用進(jìn)入Raf－MEK－ERK途徑，進(jìn)而對小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microph－thalamia－associated transcription factor，MITF）進(jìn)行調(diào)控，MITF通過與酪氨酸酶啟動子區(qū)域結(jié)合而調(diào)控TYR以及酪氨酸相關(guān)蛋白的表達(dá)［18］。黑色素的形成是由酪氨酸和苯丙氨酸經(jīng)過一系列氨化酶的催化作用而成的，其中的酪氨酸酶（TYR）是催化酪氨酸進(jìn)一步反應(yīng)的氧化酶。由此可見基因MITF和TYR是黑色素生成過程中至關(guān)重要的兩個關(guān)鍵基因，而miR－193b的靶基因Kit一定程度上調(diào)控下游基因MITF 和TYR的表達(dá)量。

4 結(jié) 論

通過在黑色素細(xì)胞中過表達(dá)miR－193b，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR－193b可以使黑色素合成路徑上有重要作用的基因MITF和TYR的mRNA和蛋白表達(dá)量均降低，結(jié)果表明，miR－193b影響黑色素細(xì)胞生成黑色素。

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（編輯 程金華）

The Influences of Over－Expressing miR－193bon MITF and TYR in Melanocytes

ZHANG Ya－ling1，XU Dong－mei2，DU Bin1，XIE Jian－shan1，F(xiàn)AN Rui－wen1，YU Xiu－ju1，ZHU Zhi－wei2，DONG Chang－sheng1*
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Abstract：MITF and TYR have been identified to be crucial in the process of melanogenesis，the study aims to investigate the relationship between MITF，TYR and miR－193b，and then to determine the functional roles of miR－193bin the regulation of melanogenesis in melanocyte.The melanocytes were transfected with the miR－193bplasmid，tested the assay of melanin，and analyzed expression patterns of MITF and TYR using real－time PCR and Western blotting.The results indicated that over－expression of miR－193bin melanocyes reduced the assay of melanin and decreased the expression of MITF and TYR both at the mRNA and protein level，the level of MITFmRNA and TYRmRNA were reduced to 0.233times（P＜0.01）and 0.198times（P＜0.01）respectively，the level of MITF and TYR proteins were reduced to 0.232times and 0.321times which was significantly different.Results support the role of miR－193bin melanocytes indirectly，which regulated the melanogenesis by MITF and TYR.

Key words：miR－193b；MITF；TYR；melanocytes

中圖分類號：S829.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0938－06

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.010

收稿日期：2015－11－09

基金項目：國家“863”計劃（2013AA102506）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303119）；農(nóng)業(yè)部“948”項目（2011－Z33）；山西省青年基金（2014021028－2）

作者簡介：張亞玲（1990－），女，山西運城人，碩士生，主要從事羊駝生物工程研究，E－mail：zyaling＿0601@163.com

*通信作者：董常生，教授，博士生導(dǎo)師，E－mail：cs＿dong@sxau.edu.cn