馬曉萌，軒俊麗，王慧華，袁澤湖，吳明明，朱才業(yè)，劉瑞鑿，魏彩虹，趙福平，張 莉，杜立新

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TXNRD1基因多態(tài)性與烏珠穆沁綿羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

馬曉萌，軒俊麗，王慧華，袁澤湖，吳明明，朱才業(yè)，劉瑞鑿，魏彩虹，趙福平，張 莉*，杜立新

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

摘 要：本研究旨在探討TXNRD1多態(tài)性與烏珠穆沁綿羊生長性狀之間的關(guān)聯(lián)性，以期找到與烏珠穆沁綿羊生長有關(guān)的分子標記。采用DNA混池測序技術(shù)篩選TXNRD1基因外顯子突變位點，并采用質(zhì)譜分型技術(shù)檢測343頭烏珠穆沁綿羊群體突變位點的基因型，并對其單個SNP及多個SNPs位點之間的組合基因型與生長性狀之間進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在該基因第1外顯子處發(fā)現(xiàn)1個C→T的錯義突變（RS10）；在第10外顯子發(fā)現(xiàn)1個A→C同義突變（RS17）；在第12外顯子處發(fā)現(xiàn)1個T→C同義突變（RS18）。χ2適合性檢驗表明，3個位點均處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。連鎖不平衡和單倍型分析表明：RS10－RS17，RS10－RS18兩個位點之間可能存在強連鎖，RS17－RS18之間弱連鎖。CAT是優(yōu)勢單倍型，其頻率為0.356。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，每個位點的3種基因型的個體在4月齡體重和胸圍上均有顯著差異（P＜0.05）。RS10位點3種基因型的個體在6月齡體重、體高、胸圍及胸寬上差異顯著（P＜0.05），RS17位點3種基因型的個體在6月齡體高上差異顯著（P＜0.05），RS18位點上3種基因型的個體在6月齡體重、體高、體斜長和胸圍上有顯著性差異（P＜0.05）。組合基因型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，不同多態(tài)位點之間的組合基因型在烏珠穆沁綿羊不同生長性狀之間差異顯著（P＜0.05）。綜上所述，可以將TXNRD1基因的多態(tài)性位點作為分子標記，在烏珠穆沁綿羊的選育中進行探索和嘗試。

關(guān)鍵詞：烏珠穆沁綿羊；TXNRD1基因；多態(tài)性；生長性狀；關(guān)聯(lián)分析

TXNRD1（Thioredoxin reductase 1）基因編碼硫氧還蛋白還原酶，也被稱作TrxR1基因。硫氧還蛋白還原酶是一種NADPH依賴的包含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，其活性與硒的含量密切相關(guān)，屬于吡啶核苷酸－二硫化物氧化還原酶家族成員，其家族包括TrxR1、TrxR2、TrxR3，是細胞內(nèi)已知的唯一能夠還原硫氧還蛋白（Trx）的酶。其中，TrxR1主要存在于細胞質(zhì)中、TrxR2主要存在于線粒體中，而TrxR3則特異性地在睪丸中表達［1］。胞質(zhì)TrxR1發(fā)現(xiàn)最早，分布也較廣泛，存在于從原核生物到人類的各級有機體細胞中，是目前研究得最多的一種同工酶。該酶具有廣泛的底物特異性［2］，既可以還原蛋白的二硫鍵，催化NADPH將小分子蛋白質(zhì)硫氧還蛋白上的二硫鍵還原，還可以還原含二硫鍵的小分子化合物，也可以還原不含二硫鍵的底物包括如維生素K3和含硒的化合物等。TrxR1可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控NADPH氧化酶的活性，從而調(diào)控胞內(nèi)活性氧水平。

正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)是還原狀態(tài)，細胞外是氧化狀態(tài)，氧化應激改變了細胞內(nèi)外的氧化還原狀態(tài)，對于細胞來說，過度的氧化應激可導致細胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷。細胞通過增加TrxR1水平來消除過氧化氫，并且抑制細胞凋亡從而能幫助細胞抵御氧化應激［3］。TrxR通過維持Trx的還原性而有利于DNA合成和抗氧化防御。研究發(fā)現(xiàn)，增加TrxR的活性可以刺激細胞增殖，降低其活性則可以加速細胞死亡［4］。TrxR過表達會加速細胞的增殖速率，比正常細胞增加2倍［5］。試驗證明，及時的上調(diào)該系統(tǒng)的活性，改變細胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)對于胸腺細胞的生存具有重要的作用［6］。TXNRD1參與了癌細胞復制的調(diào)節(jié)通路［7］，該酶的催化活性通過其碳末端活性位點Sec來發(fā)揮作用。正常的TrxR1不能誘導細胞死亡，但當把缺失最后2個氨基酸殘基（－Sec－Gly）的TrxR1再導入細胞時，細胞會受到誘導而死亡［8］。除此之外，TrxR1現(xiàn)在更被認為是最新的抗癌藥物的靶點，Trx/TrxR1系統(tǒng)在DNA合成、氧化還原調(diào)節(jié)和細胞增殖、抗氧化防御中有重要的作用［9］。綜上所述，哺乳動物TrxR1的活性與機體氧化還原功能及細胞的表型、生長及信號轉(zhuǎn)導有密切的關(guān)系。TrxR1是Nrf2－Keap1應答系統(tǒng)有效的調(diào)節(jié)器［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，TXNRD1基因與健康的無糖尿病人群的體脂肪含量呈顯著正相關(guān)（Spearman’sρ＝0.645），而肥胖人群中的該基因編碼的蛋白質(zhì)水平高［11］。安格斯雜交牛體重減少時，包括TXNRD1基因在內(nèi)的抗氧化基因的mRNA水平升高，以防止安格斯雜交?；钚匝踔卸荆?2］。J.Mitchell等［13］發(fā)現(xiàn)，位于TXNRD1基因內(nèi)含子的2個多態(tài)位點rs6539137和rs4630362與家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥顯著相關(guān)，而且rs6539137與女性家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥早期發(fā)病顯著相關(guān)，可能是一個重要的修飾基因。J.Soerensen等［14］發(fā)現(xiàn)，缺失TrxR1的小鼠體型顯著更小并且顯示共濟失調(diào)和震顫，同時觀察到顯著的小腦發(fā)育不全。推測該基因可能是通過影響肌肉和骨骼發(fā)育、脂肪代謝以及降低機體內(nèi)活性氧水平，減緩氧化損傷等方面來影響機體的生長性能。目前還未見該基因遺傳變異在綿羊上的有關(guān)報道，與生長性狀相關(guān)的研究更是鮮有報道。因此，本研究探討了TXNRD1基因的遺傳變異對烏珠穆沁綿羊的生長性狀的影響，旨在篩選與烏珠穆沁綿羊生長有關(guān)的分子標記，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

343個血液樣本采集于內(nèi)蒙古東烏珠穆沁旗原種場和正藍旗羊場。其中218個（111頭公羊，107頭母羊）血液樣本來自東烏珠穆沁原種場，125個（54頭公羊，71頭母羊）血液樣本來自正藍旗羊場。頸靜脈采血，輕微振蕩后放入－20℃保存。同時，實地測量2個羊場烏珠穆沁綿羊4月齡的體重、體高、體斜長、胸圍和管圍以及6月齡綿羊的體重、體高、體斜長、胸圍、管圍、胸寬和胸深。各試驗群體均健康無病且飼養(yǎng)管理條件一致。

1.2 基因組DNA的提取及混池

采用天根血液DNA提取試劑盒對采集到的血液樣本進行基因組DNA提取，利用NANO DROP檢測DNA樣本的濃度并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進行檢測。根據(jù)系譜信息，選擇親緣關(guān)系較遠的30個DNA樣本，均勻稀釋為50 ng·μL－1，每個樣本取2μL，均勻混合，構(gòu)建烏珠穆沁綿羊DNA混池。

1.3 外顯子序列PCR擴增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的TXNRD1基因序列（登錄號：NC＿019460.1），利用PRIMER 3在線設(shè)計軟件對該基因的全部外顯子設(shè)計引物擴增，引物信息如表1所示。引物由賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Information of primer sequences for scanning SNPs within sheep TXNRD1gene

1.4 PCR產(chǎn)物測序分析篩選SNP

混池DNA經(jīng)過PCR擴增后測序，PCR總反應體系為25μL：上下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 8.5μL。

PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，退火溫度（表1）退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶送往北京天一輝遠生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序峰圖，使用DNAMAN和Chromas 2軟件進行序列比對，篩選SNP位點。

1.5 試驗群體質(zhì)譜分型

采用Mass－array質(zhì)譜技術(shù)，在343只烏珠穆沁綿羊群體中對篩選到的SNPs位點（RS10、RS17和RS18）進行基因型分型。

1.5.1 PCR反應及產(chǎn)物純化 根據(jù)SNP位點序列信息，使用sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design 3.1設(shè)計PCR反應和單堿基擴展引物并合成。PCR反應條件：94℃預變性900s；94℃變性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共45個循環(huán)；最后72℃延伸3min；4℃保存。并對PCR產(chǎn)物進行純化，以保證單堿基延伸的準確性。PCR產(chǎn)物純化：利用SAP酶去除PCR產(chǎn)物中剩余的dNTP，可以保證單堿基延伸的準確性。反應體系：10×SAP緩沖液0.23μL，SAP酶0.4μL，水2.1 μL。反應條件：37℃進行40min，再85℃進行5 min，4℃保存。

1.5.2 單堿基延伸反應 反應條件：94℃預變性30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s，40個循環(huán)；52℃5 s，80℃5s，5個循環(huán)；最后72℃延伸3min；4℃保存。

反應體系：10×iPLEX buffer plus 1μL，iPLEX terminator 0.27μL，Primer Mix 1.1μL，iPLEX enzyme 0.06μL，ddH2O 1.05μL。

樣品樹脂純化后，使用Mass ARRAY Nanod ispenser點取純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Spectro CHIP（Sequenom）芯片上，并用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜進行分析，檢測結(jié)果用TYPER 4.0軟件完成分型，并輸出結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel 2013統(tǒng)計各個位點的等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、純合度（Ho）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），使用Haploview軟件進行位點之間的連鎖不平衡分析及單倍型構(gòu)建，并進行Hardy－Weinberg檢測。使用SPSS 22.0軟件對個體基因型與4月齡、6月齡表型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，以“最小二乘均值±標準差”表示。

統(tǒng)計模型：Y＝μ＋G＋p＋m＋e（i＝1，2）

式中，Y表示性狀測定值，μ代表群體均值，G 為TXNRD1基因型效應，p為場效應，m為性別效應，e為隨機殘差。

2 結(jié) 果

2.1 混池測序結(jié)果

在第1外顯子處發(fā)現(xiàn)1個C→T的錯義突變（RS10），在第10外顯子發(fā)現(xiàn)1個A→C突變（RS17），該突變是同義突變，在第12外顯子處發(fā)現(xiàn)1個T→C同義突變（RS18），混池測序結(jié)果見圖1。

圖1 混池測序結(jié)果Fig.1 Sequencing profiles of PCR product from DNA pooling

2.2 質(zhì)譜分型結(jié)果

采用Mass－array質(zhì)譜技術(shù)對篩選到的SNPs位點（RS10、RS17和RS18）進行基因型分型。結(jié)果顯示，每個位點都有3種基因型，其基因型分型結(jié)果見圖2－圖4。RS10位點為CC、CT、TT，RS17為 CC、CA、AA，RS18為CC、CT、TT。

2.3 試驗群體遺傳學參數(shù)

結(jié)果顯示，3個位點均處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），說明3個位點在該烏珠穆沁綿羊群體中并未受到高強度選擇，屬于隨機突變。這可能與烏珠穆沁綿羊生活地區(qū)偏遠，群體比較集中，長期閉鎖繁育有關(guān)。RS10位點的優(yōu)勢等位基因是T，頻率為0.54，優(yōu)勢等位基因型為CT，其頻率為0.47；RS17突變位點的優(yōu)勢等位基因為C，其頻率為0.64，優(yōu)勢等位基因型為CA，其頻率為0.44；RS18的優(yōu)勢等位基因為T，其頻率為0.67，優(yōu)勢等位基因性為CT，其頻率為0.45。對于這3個位點來說，頻率較高的基因型均為雜合子基因型。3個位點的有效等位基因數(shù)均接近于2，根據(jù)多態(tài)信息含量判定標準，這3個位點均屬于中度多態(tài)（0.25＜P＜0.5）。各位點群體遺傳學參數(shù)見表2。

圖2 RS10位點質(zhì)譜分型結(jié)果Fig.2 RS10loci Mass spectrometry results

圖3 RS17位點質(zhì)譜分型結(jié)果Fig.3 RS17loci Mass spectrometry results

圖4 RS18位點質(zhì)譜分型結(jié)果Fig.4 RS18loci Mass spectrometry results

2.4 連鎖不平衡分析

連鎖不平衡和單倍型分析表明，RS10－RS17，RS10－RS18兩個位點之間可能存在強連鎖不平衡（D′＞0.75，r2＞0.33）。3個位點共構(gòu)建了4種單倍型組合，其中CAT和TCC單倍型的個體數(shù)目較多，是優(yōu)勢的單倍型，而CCT單倍型的組合的個體數(shù)最少，頻率最低。各位點連鎖不平衡系數(shù)見表3。

2.5 單SNP與烏珠穆沁綿羊生長性狀間的關(guān)聯(lián)分析

單SNP關(guān)聯(lián)分析表明，RS10、RS17和RS18位點的3種基因型均在4月齡體重和胸圍上差異顯著（P＜0.05）。其中對于RS10位點來說，野生型CC基因型以及雜合子基因型CT的基因型效應大于突變的TT基因型效應。該位點是錯義突變導致了編碼氨基酸的改變。RS17和RS18位點均屬于同義突變，在RS17位點上，CA基因型的個體在4月齡體重和胸圍上顯著高于CC基因型的個體（P＜0.05），在RS18位點上，TT和CT基因型的個體在4月齡體重和胸圍上顯著高于CC基因型的個體（P＜0.05）。這3個位點其余性狀指標間無顯著差異（P＞0.05）。單SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4和表5。

表2 基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳學參數(shù)Table 2 Genotype and allele frequency and population genetic parameters

表3 烏珠穆沁綿羊TXNRD1基因多態(tài)位點連鎖不平衡和單倍型頻率分析Table 3 Linkage disequilibrium tests and haplotypic frequencies in TXNRD1gene of ujumqin sheep

表4 各位點與4月齡生長性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 4 Associations of single mutation site genotypes of the TXNRD1gene with growth traits in 4－month－age

多態(tài)位點與6月齡生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，RS10位點上的3種基因型個體在6月齡體重、體高、胸圍及胸寬上差異顯著（P＜0.05），其中CC基因型個體的6月齡體重、體高、胸圍及胸寬顯著高于TT基因型個體（P＜0.05）。RS17位點上，AA基因型的個體在6月齡體高上顯著高于CC基因型的個體（P＜0.05）。RS18位點上3種基因型個體在6月齡體重、體高、體斜長、胸圍上有顯著差異（P＜0.05），在6月齡體重上，TT和CT基因型的個體極顯著高于CC基因型的個體（P＜0.01），在6月齡體斜長和胸圍上TT基因型個體顯著優(yōu)于CC基因型個體（P＜0.05）。

2.6 組合基因型與烏珠穆沁綿羊生長性狀間的關(guān)聯(lián)分析

組合基因型與表型關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果顯示，不同的基因型組合個體在4月齡體重、胸圍上差異顯著（P＜0.05），這與單標記關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果基本一致。在RS10－RS17組合位點上，基因型CC－CA個體的4月齡體重顯著高于TT－CC基因型個體，TC－CC基因型個體的4月齡胸圍顯著高于TT－CC基因型個體（P＜0.05），在6月齡體重上，CC－CA基因型組合的個體依然最優(yōu)，顯著高于TT－CC基因型組合的個體（P＜0.05）。RS10－RS18位點上，TC－TT組合基因型的個體在4月齡體重和胸圍上顯著高于TTCC基因型組合的個體（P＜0.05），且在6月齡體重、體斜長、胸圍和胸寬上，TC－TT基因型組合的個體也顯著高于TT－CC基因型組合的個體。RS17－RS18位點上，CA－TT基因型組合的個體與CC－CC基因型組合的個體在4月齡體重上差異極顯著（P＜0.01），在4月齡胸圍差異顯著（P＜0.05）；同樣在6月齡體重、體斜長、胸圍上，CA－TT基因型組合的個體與CC－CC基因型個體之間差異顯著（P＜0.05），且CC－CC基因型組合的個體在其余各項生長性狀指標中均最低。3個位點組合基因型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，9個組合基因型之間在4月齡體重、胸圍上差異顯著（P＜0.05），TC－CC－TT組合的4月齡體重和胸圍顯著高于TT－CC－CC和TT－CC－TT基因型組合（P＜0.05），同時TC－CC－TT組合的個體在6月齡體重、體斜長、胸圍、上也顯著高于TT－CCCC和TT－CC－TT基因型組合的個體（P＜0.05）。合并基因型與4月齡、6月齡生長性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表6和表7。

2.7 生物信息學分析

對RS10位點突變前后mRNA的二級結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，其最小結(jié)構(gòu)自由能由－1 939.14kJ·mol－1變?yōu)椋? 960.04kJ·mol－1，結(jié)構(gòu)自由能降低。突變前后mRNA的二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果見圖5。

對突變前后的蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該蛋白質(zhì)中無規(guī)卷曲的比例最多，且突變前后的比例發(fā)生了變化，其無規(guī)卷曲的比例由39.22%變?yōu)?8.89%，α－螺旋的比例由26.96%變?yōu)?7.78%，β－轉(zhuǎn)角的比例由9.64%變?yōu)?.15%，延伸鏈的比例并沒有發(fā)生變化，在突變前后均為24.18%。突變前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測圖見圖6、圖7。

圖5 RS10位點不同基因型的mRNA二級結(jié)構(gòu)Fig.5 The mRNA secondary structure prediction of different genotypes at RS10site

表5 各位點與6月齡生長性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table5 Associations of single mutation site genotypes of the TXNRDI gene with growth traits in 6-month-age

表6 合并基因型與4月齡生長性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table6 Associations of combined genotypes of the TXNRDI gene with growth traits in 4-month-age

表6 （續(xù)）Table6（continued）

表7 合并基因型與6月齡生長性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table7 Associations of combined genotypes of the TXNRDI gene with growth traits in 6-month-age

圖6 TXNRD1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測（野生型）Fig.6 The secondary structure prediction of TXNRD1protein（wild type）

圖7 TXNRD1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測（突變型）Fig.7 The secondary structure prediction of TXNRD1protein（mutation type）

3 討 論

綿羊育種主要目的是改善其生長和繁殖性狀。生物體進化的過程中，其本身的遺傳特性會因為人工選擇或者環(huán)境因素等的影響而發(fā)生改變。多態(tài)信息含量、純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)等指標從不同角度反映了群體的遺傳變異水平。群體的雜合度一般認為與遺傳多樣性密切相關(guān)，群體雜合度越高，說明群體的遺傳變異較大，遺傳多樣性比較豐富。本研究中，這3個位點的雜合度均接近于0.5，這可能與烏珠穆沁綿羊生存的地理位置來自于相對偏遠的地區(qū)，并未受到高強度的選擇有關(guān)，這與本研究中H－W平衡的檢驗結(jié)一致。H－W平衡檢驗發(fā)現(xiàn)這3個位點均處于與H－W平衡狀態(tài)（P＞0.05），提示可以加大對這些位點的選擇力度。一般來說多態(tài)信息含量大，有效等位基因數(shù)相對較大，它們在大小上具有一致性。多態(tài)信息含量數(shù)據(jù)表明，這3個位點均為中度多態(tài)（0.25＜P＜0.5）。說明這些位點多態(tài)信息含量較高，選擇余地較大，暗示這些位點的整齊度還可以進一步提高。所有的突變位點在該群體中均檢測到3種基因型和2個等位基因，且這些位點的有效等位基因數(shù)均接近于2，說明這些位點在新的烏珠穆沁綿羊群體中分布較均勻。

TXNRD1基因位于綿羊的3號染色體上，編碼硫氧還蛋白還原酶，該酶包含612個氨基酸，其主要參與嘧啶代謝和含硒化合物的代謝。研究指出，TrxR1基因缺失的小鼠比正常的小鼠的體型更?。?4］，而且該基因內(nèi)含子的兩處突變位點與人類家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥顯著相關(guān)［13］，這提示我們該基因很有可能與動物的骨骼和肌肉發(fā)育有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TXNRD1基因在健康人群中的表達量顯著高于脂肪肝病患者中的表達量，同時還發(fā)現(xiàn)，高脂飲食使該基因的表達量減少，可能是由于高脂飲食改變了細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而干擾了mRNA的合成，造成了不可逆的損傷，推測該基因可能與脂肪代謝有關(guān)［15］，這個結(jié)論在小鼠上也得到了驗證［16］。因此我們把該基因作為影響動物生長發(fā)育的候選基因進行研究。本試驗中，在RS10位點上，3個不同基因型之間在烏珠穆沁綿羊的體格尺寸方面確實有顯著差異。野生型的個體基因型為CC，該基因型在4月齡體重、胸圍及6月齡體重、體高、胸圍和胸寬上顯著優(yōu)于突變的TT基因型的個體（P＜0.05），但是CC基因型的個體和TC基因型的個體之間并沒有顯著差異（P＞0.05），這提示我們該位點上的C等位基因可能是有利于機體生長發(fā)育的優(yōu)勢等位基因。野生型的個體生長性狀優(yōu)于突變型個體，可能是由于參考序列是特克賽爾綿羊的基因組序列，而特克賽爾綿羊的生長速度本身就優(yōu)于烏珠穆沁綿羊。

一般說來，表型的改變往往是由于控制該性狀的基因的功能性突變引起的，因此這種突變可以作為標記輔助育種的有效分子標記［17］。因此，為了進一步探討RS10位點的錯義突變引起生長性狀差異的原因，初步分析發(fā)現(xiàn)，該突變導致了該酶的第14位氨基酸由組氨酸變?yōu)槔野彼?，組氨酸是含R基的堿性氨基酸，是一種帶極性帶正電荷的氨基酸，酪氨酸是含R基的極性中性氨基酸，這種氨基酸的差異可能導致了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，從而引起了表型變化。我們對突變前后的mRNA和蛋白質(zhì)的結(jié)果進行了初步預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變后mRNA的二級結(jié)構(gòu)的最小自由能降低，由－1 939.14kJ·mol－1變?yōu)椋? 960.04kJ·mol－1，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，而且突變后編碼的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，其α－螺旋的比例由26.96%變?yōu)?7.78%，而其無規(guī)卷曲的比例則由39.22%變?yōu)?8.89%，而無規(guī)卷曲經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和特異功能部位，因此我們初步推斷，這種結(jié)果的改變可能影響了最終蛋白質(zhì)酶的作用效率，從而引起了表型的變化。由于該突變導致了該基因編碼的第14個氨基酸發(fā)生了改變，我們在對其蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)進行預測時發(fā)現(xiàn)，預測的結(jié)果均不能包含此突變位點，因此人們無法初步判斷突變前后該基因編碼的蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了改變，這也提示我們，該位點的功能需要進一步在蛋白質(zhì)和細胞水平上驗證。

研究指出，雖然同義突變并未引起編碼氨基酸的改變，但依然影響動物的表型變化，主要通過以下兩種途徑，一是改變mRNA的穩(wěn)定性［18］，二是可能是通過影響密碼子的偏好性，改變蛋白質(zhì)亞基的結(jié)構(gòu)和功能［19］，最終影響了蛋白質(zhì)的生物學功能。周明亮等［20］發(fā)現(xiàn)，在IGF－1外顯子3的A→G突變并未引起氨基酸的改變，但是該多態(tài)位點與綿羊出生后斷奶體重和斷奶后日增重存在相關(guān)性。本試驗中RS17和RS18位點均屬同義突變。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，RS17位點上的AA基因型個體在烏珠穆沁綿羊4月齡體重、胸圍和6月齡體高上與CC基因型的個體差異顯著（P＜0.05）。在RS18位點上，TT基因型的個體不僅在4月齡體重和胸圍上顯著優(yōu)于CC基因型的個體（P＜0.05），在6月齡體重、體高、體斜長、胸圍上也同樣優(yōu)于CC基因型的個體，由此我們推測，在RS17和RS18位點上，AA/CA和TT基因型分別為有利于烏珠穆沁綿羊生長的優(yōu)勢基因型。隨著對SNPs研究的深入，越來越多的與表型顯著相關(guān)的SNPs位點被發(fā)現(xiàn)并不是引起表型改變的致因突變，而是通過與影響表型的致因突變位點一起處于連鎖不平衡狀態(tài)，而與致因突變相互作用，從而間接影響了氨基酸甚至蛋白質(zhì)的變化，最終導致了表型的變化［21－22］。因此，RS17和RS18位點可能也是通過與主效基因相互連鎖最終影響了烏珠穆沁綿羊的表型性狀，也可能是由于這些同義突變引起了TXNRD1基因在不同時間點和不同組織的表達差異，從而引起了機體內(nèi)調(diào)控代謝途徑的變化，最終引起了表型的變化，這提示人們下一步需要通過研究該基因在表達水平上的差異來進行該基因的功能驗證。

研究發(fā)現(xiàn)，多態(tài)位點之間的組合效應對物種的表型也有重要影響［23］，在某種程度上比單個SNP的影響更能反映真實情況。本研究發(fā)現(xiàn)，RS10－RS18組合基因型之后，原來2個位點在4月齡體高上均無顯著性差異，但是組合基因型之后，出現(xiàn)了顯著性差異，且TC－TT基因型組合個體的6月齡體高最高，顯著優(yōu)于TT－CT和TT－TT基因型個體（P＜0.05）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，不論是單SNP關(guān)聯(lián)分析還是2個SNPs位點的組合基因型分析，在RS17和RS18兩個位點上，CC基因型和CC－CC基因型的個體在大部分生長性狀指標上都是最低的，由此推斷RS17和RS18的C等位基因不是有利于烏珠穆沁綿羊生長的最優(yōu)等位基因，而CA－TT基因型組合的生長性狀指標較高。進一步關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，RS10－RS17的組合基因型TC－CC在4月齡體重和胸圍上優(yōu)于其他的基因型組合，當這種基因型組合與RS18位點的優(yōu)勢基因型TT組合后，TCCC－TT基因型組合的個體在4月齡體重和胸圍等方面優(yōu)于其他的基因型組合，且均高于組合前各自的單獨的4月齡體重和胸圍，這一結(jié)果與6月齡體重、體斜長、胸圍和胸寬的結(jié)果，說明優(yōu)勢的TC－CC 和TT基因型組合在一起后共同發(fā)揮了正效應，初步判斷TC－CC－TT基因型組合可能是影響烏珠穆沁綿羊體重和胸圍的有利基因型，但是由于其個體較少，因此在以后的選育過程中可以加大對該組合基因型的選擇。

目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)TXNRD1基因與生長性狀的相關(guān)報道，本試驗結(jié)果揭示了TXNRD1基因與烏珠穆沁綿羊生長性狀的顯著關(guān)聯(lián)性，為進一步研究該基因的功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)，但是由于綿羊的生長性狀受到如初生重、年齡、性別、采食方式等多種因素的影響，這提示人們可以通過擴大樣本量、檢測該基因不同基因型在不同組織和時間段的表達量及細胞水平等多個方面對該基因進行進一步深入研究，以期為綿羊分子育種提供有利的分子標記。

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（編輯 郭云雁）

TXNRD1Gene Polymorphisms and Its Association with Growth Traits in Ujumqin Sheep

MA Xiao－meng，XUAN Jun－li，WANG Hui－h(huán)ua，YUAN Ze－h(huán)u，WU Ming－ming，ZHU Cai－ye，LIU Rui－zao，WEI Cai－h(huán)ong，ZHAO Fu－ping，ZHANG Li*，DU Li－xin
（Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the association between the TXNRD1gene polymorphisms and the sheep growth traits，and to find the molecular markers related to the growth traits of Ujumqin sheep.The variations in the exons of TXNRD1gene were detected using DNA pool technology.Then Sequenom Mass－array technology was used to detect the genotypes at the mutation sites of the TXNRD1gene in 343Ujumqin sheep.The polymorphisms of TXNRD1gene and its association with growth traits of Ujumqin sheep were analyzed by SPSS 22.0software.The results showed that the C→T missense mutation（RS10）in exon 1，the A→C synonymous mutation（RS17）in exon 10and the T→C synonymous mutation（RS18）in exon 12 were found，respectively.The x2test showed that all the 3sites were in Hardy－Weinberg equilibrium（P＞0.05）.Then linkage disequilibrium and haplotypes were analyzed，the results showedthat RS10－RS17，RS10－RS18were strongly linked，while RS17－RS18were weakly linked.The dominant haplotype was CAT with a frequency of 0.356.Assocition analysis suggested that 3genotypes at each mutation site had significant difference in 4－month－age weight and chest girth（P＜0.05）.The 3genotypes of RS10showed significant difference in 6－month－age weight，body height，chest girth and chest width（P＜0.05）.At RS17site，the 3genotypes also had significant difference in 6－month－age body height（P＜0.05）.At RS18site，there were significant difference among the 3genotypes in 6－month－age weight，body height，body length and chest girth（P＜0.05）.Meanwhile，the different combined genotypes showed significant difference in various Ujumqin growth traits（P＜0.05）.Therefore，the results suggest that TXNRD1mutation sites maybe markers related to the Ujumqin sheep growth traits and can be used as candidate markers in Ujumqin sheep molecular breeding.

Key words：Ujumqin sheep；TXNRD1gene；polymorphism；growth traits；association analysis

中圖分類號：S826；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－0909－13

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.007

收稿日期：2015－07－24

基金項目：中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（2014ywf－yb－7）；國家“十二五”863項目“綿羊肉用性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析研究”（2011AA100307－03）

作者簡介：馬曉萌（1990－），女，河南南陽人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面的研究，E－mail：mxm90511@163.com

*通信作者：張 莉，副研究員，Tel：010－62818815，E－mail：Zhangli@263.net