劉　勇，安艷芳，王仲霞，楊建業(yè)，吳　君

(1南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳　518101； 2 湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰　442000)

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細胞穿透肽CCL融合蛋白的構建與表達

劉勇1，2，安艷芳2，王仲霞2，楊建業(yè)2，吳君2

(1南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳518101； 2 湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰442000)

[摘要]目的評估細胞穿透肽CCL融合蛋白構建的可能性。方法將CCL6-PEP-6XHis構建至pABP質粒，然后提取pABP-CCL6-PEP質粒進行人胚腎HEK293細胞轉染表達，以及CCL6-PEP-6XHis 蛋白層析純化和檢測。結果成功構建并純化細胞穿透肽CCL融合蛋白。將CCL6-PEP-6XHis Tag 基因經(jīng)PCR擴增、接入T 載體、克隆、培養(yǎng)，并提取質粒進行測序鑒定，所得序列與目的基因一致。成功將CCL6-PEP-6XHis基因構建至哺乳動物細胞表達載體pABP 中，經(jīng)質粒提取和酶切鑒定，電泳結果顯示，HindⅢ + XbaⅠ切出約430 bp的條帶，符合預期，酶切鑒定正確。蛋白質印跡法(Western Blot)檢測結果陽性，表明純化得到的目標蛋白帶有hisx6標簽。結論細胞穿透肽CCL融合蛋白能夠人工構建，并通過真核細胞進行表達。

[關鍵詞]細胞穿透肽； CCL； 基因表達； 重組融合蛋白質

[Chin J Infect Control，2016，15(6)：361-366]

由于多重耐藥菌傳播快，開發(fā)新的抗菌藥物迫在眉捷，是重要的醫(yī)學問題[1]。抗菌肽(antibacterial peptides)是廣泛存在于動植物體內，具有一定抗菌譜的小分子肽，是哺乳動物抗感染防御中的重要成分,可參與先天免疫和炎性應答諸多方面,具有保守的信號轉導通路[2-6]。CCL6是抗微生物肽(AMP)的重要一員，在腸道等器官大量分布，易于提取，是具有臨床潛力的藥物之一[7-8]。但CCL6由于分子小，易被蛋白酶降解,限制了其臨床應用。利用新型技術提高抗菌肽的穿透力，是抗菌肽研究的熱點和關鍵問題[7,9]。假設細胞穿透肽也可以促進抗菌肽的定位及提高局部濃度，從而可大幅度提高抗菌肽的體內外抗菌活性。本研究評估構建細胞穿透肽CCL6融合蛋白的可能性。

1材料與方法

1.1實驗材料人胚腎HEK293細胞(ATCC,Catalog #CRL21573) 為本研究室保存。大腸埃希菌DH5α、質粒pSectagA、pEGFP2C1、哺乳動物細胞表達載體pABP、CD 293 TGE medium、(cat#CM-1156) BP fectin轉染試劑購自北京百普賽斯生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1CCL6-PEP-6XHis基因密碼子優(yōu)化及合成在Pubmed上查詢CCL6及PEP蛋白基因序列，利用Premier Primer軟件進行密碼子優(yōu)化后，設計合成的CCL6-PEP-6XHis Tag基因，再根據(jù)目的基因設計引物進行聚合酶鏈反應(PCR)。切膠回收目的片段，將PCR 產(chǎn)物連入T 載體，挑取克隆進行培養(yǎng)，提取質粒進行測序鑒定。通過比對，獲得正確的CCL6-PEP-6XHis 基因序列。

1.2.2質粒pABP-CCL6-PEP重組和酶切、測序鑒定CCL6-PEP基因片段以Hind Ⅲ和入XbaⅠ雙酶切,并與同樣酶切的pABP載體于14℃連接過夜, 連接產(chǎn)物轉入50 μL Top10 感受態(tài)細胞，挑取4個單菌落過夜振蕩培養(yǎng)后,提取質粒并進行酶切鑒定。反應均按常規(guī)方法操作，利用Primer軟件設計添加含Hind Ⅲ和入XbaⅠ酶切位點的CCL6-PEP-6Xhis的產(chǎn)物引物，并利用所設計引物進行PCR。將PCR產(chǎn)物導入pABP HindⅢ + XbaⅠ酶切線性化載體，再將連接產(chǎn)物轉入50 μL Top10 感受態(tài)細胞，接種平板過夜培養(yǎng)，挑取若干單菌落過夜振蕩培養(yǎng)后，提取質粒；對所提質粒進行Hind Ⅲ + XbaⅠ酶切鑒定，并進行測序鑒定。

1.2.3CCL6-PEP-6XHis質粒制備與瞬時轉染將鑒定正確的質粒轉化到DH5a菌中，接種平皿挑取單菌落放大培養(yǎng)，并用DNA提取試劑盒制備轉染用質粒DNA。將HEK293細胞以0.5×106cells/mL 接種密度接種至 3 L細胞培養(yǎng)反應器中，初始工作體積為1.2 L，培養(yǎng)溫度37℃攪拌轉速150 r/min。當活細胞密度達(1.5～2.0)×106cells/mL 時, 用0.8 L 的新鮮無血清/化學成分界定培養(yǎng)基(CD 293 TGE medium)稀釋至終體積為2.4 L?；罴毎芏认♂尯?5 h再度達到(1.5～2.0)×106cells/mL 時，用BP fectin作為轉染試劑，以3 μL轉染試劑/106細胞, 和1 μL DNA/106細胞的劑量轉染細胞。轉染復合物根據(jù)ACRO Biosystems 說明書進行，并在轉染24 h后，以5%/5% (V/V) 比例加入Feed X Supplement補料, 并在轉染24 h 和96 h后分別加入ACRO Biosystems 20 mmol/L 及4 mmol/L葡萄糖和谷氨酰胺濃縮液。整個細胞培養(yǎng)過程中，每天觀察計數(shù)細胞，并在轉染后收獲HEK293細胞培養(yǎng)液。

1.2.4CCL6-PEP-6XHis蛋白的層析純化和檢測收集無血清細胞培養(yǎng)液，經(jīng)低速離心去除細胞和細胞碎片，所得培養(yǎng)液上清采用0.45 μm濾膜過濾、澄清，去除細胞碎片顆粒，使用5 mL金屬螯合親和層析進行分離，依次采用40、100、250 和500 mmol/L咪唑階段梯度進行洗脫，對洗脫物進行SDS-PAGE 電泳檢測。然后使用Anti-hisx6 抗體對Peak4(峰4)進行蛋白質印跡法(Western Blot)檢測。

2結果

2.1CCL6-PEP-6XHis基因密碼子優(yōu)化及合成經(jīng)過Primer軟件進行密碼子優(yōu)化后，需要合成的CCL6-PEP-6XHis Tag 基因見圖1～2。針對該序列共設計18條引物(CCL6-01、02……18 )進行PCR擴增，切膠回收目的片段，連接PCR產(chǎn)物入T 載體，挑取若干克隆進行培養(yǎng)，并提取質粒進行測序鑒定，所得序列符合目的基因。

藍色部分：mouse CCL6 序列；紅色部分：PEP1 序列；黃色部分：6XHis Tag 序列

圖2　CCL6-PEP-6XHis基因PCR產(chǎn)物電泳圖

Figure 2Electrophoretogram of PCR product of CCL6-PEP-6XHis gene

2.2質粒pABP-CCL6-PEP 重組成功將CCL6-PEP-6XHis基因構建至哺乳動物細胞表達載體pABP 中。設計載體構建引物，設計的引物進行PCR 擴增。見表1、圖3。

2.3細胞轉導PCR產(chǎn)物導入pABP Hind Ⅲ + XbaⅠ酶切線性化載體，再將連接產(chǎn)物轉入50 μL Top10 感受態(tài)細胞，接種平板過夜培養(yǎng)。隔夜培養(yǎng)平板培養(yǎng)出>100 個單菌落。見圖4。

表1　設計載體構建引物

A:PCR粗產(chǎn)物;B:回收產(chǎn)物;C:酶切后產(chǎn)物

Figure 3Electrophoretogram of PCR product, extracted PCR product, and restriction enzyme-digested PCR product of pABP-CCL6-PEP gene

圖4　質粒pABP-CCL6-PEP重組克隆隔夜培養(yǎng)平板

Figure 4Overnight incubated plates of recombinant clones of plasmid pABP-CCL6-PEP

2.3.1酶切鑒定挑取4 個單菌落過夜振蕩培養(yǎng)后，提取質粒，對所提的4 管質粒進行酶切鑒定，電泳結果顯示，HindⅢ + XbaⅠ切出約430 bp的條帶，符合預期，表明酶切鑒定正確。見圖5。

圖5　質粒pABP-CCL6-PEP及其酶切鑒定電泳圖

Figure 5Electrophoretogram of plasmid pABP-CCL6-PEP and restriction enzyme digestion

2.3.2表達載體測序結果對表達載體pABP-CCL6-PEP進行測序鑒定，比對結果表明，測序完全正確，符合設計。見圖6。

圖6　pABP-CCL6-PEP基因測序圖

2.4CCL6-PEP-6XHis質粒制備與瞬時轉染

2.4.1CCL6-PEP-6XHis質粒制備將鑒定正確的質粒轉化到DH5a菌中，接種平皿培養(yǎng)后挑取單菌落放大培養(yǎng)，并用DNA提取試劑盒制備轉染用質粒DNA。提取質粒名稱CCL6-PEP-6XHis，DNA比光度為1.82，數(shù)量為13.2，轉染DNA為3.8 mg。

2.4.2細胞培養(yǎng)與瞬時轉染細胞培養(yǎng)進行轉染后的生長曲線見圖7。細胞峰活細胞密度(Peak VCD)達4.8 million/mL，總細胞密度(TCD)達7.66 million/mL，活細胞比VCD/TCD為63%。

2.5CCL6-PEP-6XHis蛋白的層析純化和檢測

2.5.1CCL6-PEP-6XHis蛋白層析純化約2.8 L無血清細胞培養(yǎng)液經(jīng)過15 min低速離心(4 000 r/min)去除細胞和細胞碎片，依次采用不同濃度咪唑階段梯度進行洗脫，層析分離圖譜見圖8。以上金屬螯合親和層析收集各洗脫峰，SDS-PAGE還原電泳檢測。峰4(P4)為500 mmol/L咪唑洗脫后所得目標蛋白。總細胞上清液為2 650 mL,目標蛋白約43 mL,根據(jù)紫外分光儀波長280 nm檢測，目標蛋白低于最低檢測閾值。

圖7CCL6-PEP-6XHis質粒在HEK293細胞中瞬時表達生長曲線

Figure 7Growth curve of transient expression of plasmid CCL6-PEP-6XHis in HEK293 cell

2.5.2目標蛋白SDS-PAGE電泳分析根據(jù)SDS-PAGE電泳分析(見圖9)，目標蛋白(約15 kD)與金屬螯合填料(IMAC)結合較強，需使用500 mmol/L 咪唑洗脫(P4)。根據(jù)電泳條帶估計，純化得到0.05～0.1 mg痕量目標蛋白，當前方案的表達量較低。

圖8　CCL6-PEP-6XHis蛋白金屬螯合親和層析分離純化層析圖譜

柱M:蛋白Marker;柱1:細胞培養(yǎng)上清液；柱2:未洗脫前離心液；柱3—5: 分別為40、100、250 mmol/L 咪唑洗脫后；柱6:第三峰(P3)尾峰的250 mmol/L咪唑洗脫后；柱7—8: 500 mmol/L 咪唑洗脫后 (CCL-PEP-6XHis)，其中柱8采用20倍濃縮

圖9CCL6-PEP-6XHis蛋白層析分離純化還原電泳分析圖

Figure 9Electrophoretogram of chromatographic separation and purification of CCL6-PEP-6XHis protein

2.6CCL6-PEP-6XHis蛋白Western Blot檢測使用Anti-hisx6抗體對P4進行Western Blot檢測，結果確定為陽性，表明純化得到的目標蛋白帶有hisx6標簽，但由于濃度較低，顯色條帶肉眼觀察較淺。見圖10。

1泳道：陽性對照；2泳道：空白對照； 3泳道：Marker； 4泳道：洗脫后的P4

圖10CCL6-PEP-6XHis蛋白Western Blot 檢測結果

Figure 10Western Blot analysis on CCL6-PEP-6XHis protein

3討論

多重耐藥菌是臨床期待解決的問題。腸道分泌的CCL6具有廣泛抗病原體作用，且對人體無害，是一種理想的候選抗菌藥物[7,10-12]。但CCL6由于分子小,易被蛋白酶降解,限制了其臨床應用。利用新型技術提高抗菌肽的穿透力，是抗菌肽研究的熱點和關鍵問題。本研究成功構建了細胞穿透肽CCL6融合蛋白，為進一步高表達目的蛋白及體內外實驗奠定了基礎。

研究[13]表明，HEK293細胞是比較理想的宿主細胞。本課題中的CCL6由于具有殺菌作用，不宜于采用傳統(tǒng)的大腸埃希菌培養(yǎng)。初試中載體細菌起初濃度呈指數(shù)增加，但隨時間進展，尤其3 d后數(shù)量又呈指數(shù)下降，大腸埃希菌表達的CCL6由于自身的殺傷作用導致產(chǎn)量低下。表明CCL6具有強大的殺菌作用，且與濃度呈正相關，大腸埃希菌并非其理想表達系統(tǒng)。由于CCL6機制主要為破壞細菌細胞壁，因而對細胞無損傷[10]。本組研究采用HEK 293細胞作為宿主細胞，避免了對宿主的破壞，提高了蛋白的產(chǎn)出率。

CCL6的最低抑菌濃度值較高，達到理想殺菌效果的濃度需100 nmoL左右，表明CCL6的細胞壁穿透能力有待進一步提高。該濃度的CCL6價格昂貴，限制了其在臨床廣泛使用。因而增強CCL6的透壁能力十分必要。PEP-1是一種穿透蛋白，能夠增強靶分子的細胞壁穿透能力。既往研究[14-15]表明，PEP-1能夠增強靶蛋白的穿透能力，提高生物活性，如SOD,EGFP和過氧化氫酶等。理論上PEP-1可以提高CCL6的穿壁能力，但能夠提高CCL6的穿壁能力是否一定提高殺菌能力尚需要進一步研究。本研究為進一步評估CCL6的殺菌機制，開發(fā)新一代抗菌素奠定了技術基礎。本研究的限制之處為靶蛋白的濃度和產(chǎn)量還不夠高，未來實驗中需要予以進一步改良和優(yōu)化。

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(本文編輯：左雙燕)

Construction and expression of cell-penetrating peptide CCL fusion protein expression vector

LIUYong1,2,ANYan-fang2,WANGZhong-xia2,YANGJian-ye2,WUJun2

(1ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity,Shenzhen518101,China; 2RenminHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the construction of expression vector for fusion protein of cell-penetrating peptide CCL (PEP-CCL). MethodsCCL6-PEP-6XHis was inserted into plasmid pABP, pABP-CCL6-PEP plasmid was extracted and then transfected into HEK293 cells, CCL6-PEP-6XHis was expressed and purified by chromatography and detected with Western Blot. ResultsPEP-CCL express vector was successfully constructed and purified. PCR product of CCL6-PEP-6XHis Tag was ligated with T vector, recombinant was transferred into the host cells, then host cells were cultured, plasmid was extracted and sequenced, the sequence was identical to targeted gene. CCL6-PEP-6XHis was successfully inserted into the eukaryotic expression vector pABP, plasmid was extracted and digested, electrophoresis results revealed that a fragment with 430bp was digested by Hind Ⅲ+XbaⅠ, which was identical to the expected value. Western Blot revealed that CCL6-PEP fusion protein could be recognized by His monoclonal antibody. ConclusionPEP-CCL express vector can be constructed and expressed in eukaryotic cells.

[Key words]cell-penetrating peptide; CCL; gene expression; recombinant fusion protein

[收稿日期]2015-08-23

[基金項目]湖北省教育廳重點項目支持(D20112101)

[作者簡介]劉勇(1973-)，湖北省十堰市人，男(漢族)，副主任醫(yī)師，主要從事危重病研究。 [通信作者]吳君E-mail:1091372776@qq.com

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.06.001

[中圖分類號]R3Q2-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-9638(2016)06-0361-06

·論著·