胡東方 程子龍 劉 朋 肖一紅 屈亞錦 劉思當(dāng)（山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271000）

?

試驗(yàn)研究

牛病細(xì)菌分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)

胡東方 程子龍 劉 朋 肖一紅 屈亞錦 劉思當(dāng)*
（山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271000）

摘要本文就接診的牛細(xì)菌性呼吸道病例采集的117份奶樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，牛病常見致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，僅有少數(shù)幾種藥物，如頭孢類及喹諾酮類藥物能夠發(fā)揮有效抗菌作用。

關(guān)鍵詞牛病 細(xì)菌分離 鑒定 藥敏試驗(yàn)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及居民生活水平的提高，民眾對(duì)肉、奶的消費(fèi)水平也越來越高，這在很大程度上促進(jìn)了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。但是頻繁的犢牛貿(mào)易、流動(dòng)以及越來越大的規(guī)?；?chǎng)出現(xiàn)使得牛細(xì)菌性疾病呈現(xiàn)出一些新的流行特點(diǎn)，細(xì)菌性疾病成為影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的主要因素，如何高效防控牛病成為養(yǎng)牛業(yè)的一大難題。據(jù)調(diào)查，當(dāng)前除牛布氏桿菌病、結(jié)核病、副結(jié)核病等需要檢測(cè)凈化的疾病外，由巴氏桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等引起的運(yùn)輸熱、乳房炎、腹瀉等也成為影響?zhàn)B牛業(yè)發(fā)展的重要疾?。?，2］。在當(dāng)前細(xì)菌耐藥性普遍及食品安全問題頻出的背景下，要想準(zhǔn)確、高效地對(duì)牛常發(fā)細(xì)菌病進(jìn)行診斷和防控，必須依賴實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和藥物敏感試驗(yàn)。本文就接診的牛細(xì)菌病病例的實(shí)驗(yàn)室診斷及藥敏試驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)，希望能為牛場(chǎng)常見細(xì)菌性疾病的病原學(xué)研究及藥物防治提供理論依據(jù)和防控思路。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年4月至2015年10月間接診山東各地70余個(gè)牛場(chǎng)的呼吸道病及犢牛腹瀉病例，并采集奶樣117份。

1.2 方法

對(duì)疑似細(xì)菌病病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室綜合診斷和藥敏試驗(yàn)，并針對(duì)性地提出了防控方案。

2 結(jié)果

2.1 牛巴氏桿菌病

牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種敗血性傳染病，臨床上以高熱、肺炎或急性胃腸炎并發(fā)多器官廣泛性出血為主要特征［3］。巴氏桿菌為革蘭氏陰性菌，用堿性美蘭染色血涂片或組織觸片后可發(fā)現(xiàn)兩端深染的短桿菌。一般認(rèn)為該菌為條件性致病菌，平時(shí)即大量寄生在牛的上呼吸道黏膜和消化道黏膜上，當(dāng)機(jī)體受到各種應(yīng)激因素刺激后而導(dǎo)致抵抗力下降時(shí)，該菌便可乘虛而入，經(jīng)血液循環(huán)遍布全身多個(gè)組織器官而發(fā)生內(nèi)源性感染和發(fā)病［4］。之前一般認(rèn)為牛運(yùn)輸熱的發(fā)生與多殺性巴氏桿菌的感染直接相關(guān)，但最近研究發(fā)現(xiàn)，牛運(yùn)輸熱的發(fā)生是由多種病原微生物感染引起的以高熱、間質(zhì)性及大葉性肺炎為主的一種應(yīng)激性綜合征，當(dāng)然，巴氏桿菌在該病的發(fā)生中起到重要作用。

2.1.1 臨床癥狀和病理變化 病牛呈精神沉郁、目光呆滯、離群獨(dú)處、食欲廢絕、反芻減少或停止，體溫38.9～40.8℃，嚴(yán)重的患牛抽搐后死亡。剖檢可見病牛肺臟高度腫脹，呈暗紅色實(shí)變、質(zhì)度較硬（圖1），肺切面小葉間隔水腫、增寬；氣管環(huán)充血、氣管內(nèi)有泡沫樣液體（圖2）；肝臟暗紅色淤血腫脹、質(zhì)脆；腸黏膜、腸漿膜均見有彌散性出血斑點(diǎn)，腸黏膜脫落；胃黏膜有彌漫性出血。

圖1 病牛肺臟暗紅色實(shí)變、肺小葉間隔增寬

圖2 病牛氣管環(huán)充血、管腔內(nèi)有大量泡沫性液體

2.1.2 實(shí)驗(yàn)室診斷（1）細(xì)菌分離與純培養(yǎng)：無菌條件下從病牛肺臟、喉頭中分離病料劃線接種于綿羊血瓊脂平板，倒置放在37℃培養(yǎng)箱中24h后，可見在血平板上形成灰白色濕潤而黏稠菌落，無溶血現(xiàn)象。在45°折光下，呈現(xiàn)鮮明的藍(lán)綠色并帶金屬光澤，邊緣有狹窄的紅黃色帶。（2）菌落鑒定：挑取單個(gè)菌落、涂片，干燥后經(jīng)瑞氏染色，鏡下可見兩極著色的短桿菌（圖3）；經(jīng)革蘭氏染色可見呈革蘭氏陰性的短桿菌（圖4）。（3）細(xì)菌生化試驗(yàn)：分離培養(yǎng)物在進(jìn)行生化鑒定前需要先檢查培養(yǎng)物的純度。將菌株分別劃線接種血平板，37℃培養(yǎng)24h后觀察。如劃線平板上生長的菌落分布均勻，有可供觀察的一定數(shù)量的單個(gè)菌落，通過不同光角度觀察和比較菌落的一致性。如菌落形態(tài)特征一致，可作為鑒定用菌株；若菌落特征不一致，則需要繼續(xù)進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至菌落形態(tài)一致或80%以上菌落一致即可。菌落形態(tài)特征一致的菌落，先進(jìn)行涂片和革蘭氏染色，鏡檢特征為革蘭氏陰性短桿菌后方可進(jìn)行生化鑒定。生化鑒定可進(jìn)行如下項(xiàng)目的測(cè)定：葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、吲哚、VP等，按照說明進(jìn)行試驗(yàn)。巴氏桿菌能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖及甘露醇；不發(fā)酵麥芽糖、乳糖；吲哚試驗(yàn)陽性；VP試驗(yàn)陰性。（4）巴氏桿菌PCR檢測(cè)：根據(jù)GenBank公布的序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游：ATCCGCT ATTTACCCAGTGG；下游：GCTGTAAACGAACTCGC CAC，擴(kuò)增片段長度457bp［5］。用接種環(huán)挑取單菌落，均勻混于含50μl無菌水的離心管中，置于100℃水浴中煮5～10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，10000rpm離心2min，上清即為PCR模板。按照常規(guī)PCR體系和反應(yīng)條件（退火溫度56℃）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（5）藥敏試驗(yàn)：藥敏試驗(yàn)可用紙片擴(kuò)散法和梯度稀釋法進(jìn)行，目前常用較為經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的紙片法（K-B法）。挑取已鑒定好的巴氏桿菌單菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)（37℃，16～24h）。比濁法計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)基稀釋至3×109個(gè)/ml［4］。用滅菌棉拭子蘸取稀釋后的菌液均勻涂抹于血平板（或吸取30μl菌液至平板上，用滅菌L棒均勻涂滿平板），待菌液吸收后，按照?qǐng)D5所示貼藥敏紙片（每兩個(gè)紙片的中心間距應(yīng)不低于24mm）。將貼完藥敏紙片的平皿置于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)16～24h后觀察結(jié)果。根據(jù)抑菌圈直徑判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

圖3 瑞氏染色可見巴氏桿菌為兩極深染的短桿菌

圖4 革蘭氏染色　為陰性短桿菌

圖5 直徑9cm平板貼藥敏片示意圖

經(jīng)分離培養(yǎng)及鑒定，共從28份疑似病料中分離得到16株巴氏桿菌，對(duì)這16株分離菌進(jìn)行了以下藥物的藥敏試驗(yàn)：強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考。藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 巴氏桿菌藥物敏感情況 （%）

2.2 奶牛乳房炎

奶牛乳房炎是由物理、化學(xué)或微生物等因素刺激奶牛乳腺而引發(fā)的一種炎癥反應(yīng)，其中多種病原微生物如葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌等細(xì)菌的感染是引起該病的主要原因。該病已經(jīng)成為危害世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一［6］。據(jù)世界奶牛協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，該病在多個(gè)國家和地區(qū)普遍發(fā)生，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)50%，中國奶牛隱性乳房炎的陽性率介于46.4%～85.7%之間［7，8］。當(dāng)前，主要采取抗生素療法對(duì)該病進(jìn)行防治，由于臨床治療過程中存在盲目使用、大劑量或長時(shí)間使用抗生素等諸多問題，致使療效較差及耐藥菌株不斷增加，非但提高養(yǎng)殖成本、不利于奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，還會(huì)通過殘留在乳中的抗菌藥物威脅人類健康［9］。因此，及時(shí)準(zhǔn)確地掌握奶牛乳房炎相關(guān)病原的種類及藥物敏感性，將有助于指導(dǎo)臨床合理用藥及提高該病的防治效果，對(duì)乳房炎相關(guān)致病菌的耐藥性研究也大有裨益。

2.2.1 奶樣采集 從山東地區(qū)共采集奶樣117份，樣品為臨床型或亞臨床型乳房炎（根據(jù)SMT檢測(cè)結(jié)果而篩選的）患牛奶樣。人工擠奶，采樣前對(duì)奶牛乳房及擠奶工雙手進(jìn)行消毒，手工擠去前3把奶，而后將奶擠至滅菌的10ml離心管中，標(biāo)記后冰浴中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室待檢。送檢的奶樣短時(shí)間保存于4℃冰箱中，并在12h內(nèi)開展細(xì)菌分離工作。

2.2.2 細(xì)菌分離與純培養(yǎng) 將無菌采集的奶樣搖勻后，分別取0.1ml接種于綿羊血瓊脂平板及伊紅美藍(lán)瓊脂平板中，用滅菌L棒涂布均勻。將涂布后的平板倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。金黃色葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)為黃色或白色大菌落，周圍有完全透明溶血圈（圖6）；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陽性、排列成葡萄串樣或短鏈簇狀的球菌；將疑似金黃色葡萄球菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進(jìn)行純培養(yǎng)。鏈球菌在血平板上的菌落形態(tài)為有溶血環(huán)或無溶血環(huán)的圓形突起的細(xì)小菌落；挑取疑似鏈球菌菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陽性、排列成長鏈狀的球菌；將疑似鏈球菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進(jìn)行純培養(yǎng)。大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板中的菌落形態(tài)為紫黑色并帶有綠色金屬光澤的菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的棒狀桿菌；將疑似大腸桿菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進(jìn)行純培養(yǎng)。

圖6 葡萄球菌在血平板上形成黃色或白色大菌落，周圍有透明溶血環(huán)

2.2.3 細(xì)菌生化鑒定（1）疑似葡萄球菌用觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)等葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行鑒定。疑似鏈球菌的用CAMP試驗(yàn)、6.5%NaCl肉湯生長試驗(yàn)、七葉苷及馬尿酸鈉發(fā)酵試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定。疑似大腸桿菌的用乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、三糖鐵、吲哚、甲基紅及VP試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。（2）從117份奶樣中共分離到致病菌107株，其中金黃色葡萄球菌70株，占分離菌株的65.4%；無乳鏈球菌27株，占分離株的25.2%；大腸桿菌10株，占分離株的9.3%。在采集的117份奶樣中，未分離出細(xì)菌的奶樣有11份，可能為非特異性乳房炎或是由其他病原微生物引起。106份有菌奶樣中，多數(shù)樣本（79/106）只分離到一種優(yōu)勢(shì)菌，其余27份奶樣（25.5%）中分離得到兩種或兩種以上細(xì)菌。乳房炎奶樣分離到的細(xì)菌感染情況見表2。

表2 乳房炎樣本的細(xì)菌感染情況

2.2.4 藥敏試驗(yàn) 經(jīng)分離培養(yǎng)及鑒定，將分離到的107株致病菌進(jìn)行了以下藥物的藥敏試驗(yàn)：青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、氧氟沙星、紅霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考。藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 藥物對(duì)三種病原菌的平均抑菌圈直徑（mm）

2.3 犢牛腹瀉

犢牛腹瀉是指斷奶前的犢牛所發(fā)生的一種以消化不良及腹瀉為主要特征的消化道疾病。該病是由腸道內(nèi)的細(xì)菌、病毒或寄生蟲等病原微生物或是營養(yǎng)性因素、環(huán)境因素致使機(jī)體抵抗力下降及發(fā)病后所表現(xiàn)出來的一種多因素綜合征，是造成犢牛死亡、生長發(fā)育不良且危害犢牛養(yǎng)殖最為嚴(yán)重的疾病之一，給牛場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展［10］。引起犢牛腹瀉的細(xì)菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及魏氏梭菌等，單一細(xì)菌的感染往往不會(huì)引起嚴(yán)重的腹瀉，往往是伴隨著飼養(yǎng)管理因素或應(yīng)激因素一起導(dǎo)致犢牛抵抗力下降、腸道菌群失調(diào)，加之細(xì)菌感染而誘發(fā)嚴(yán)重的腹瀉［11，12］。因此，如何預(yù)防和治療犢牛腹瀉就成了急需解決的難題。目前，對(duì)犢牛腹瀉病的治療主要采用抗生素治療并結(jié)合支持療法，由于致病因素眾多，針對(duì)性不強(qiáng)，臨床治療效果往往不夠理想，加之長期而廣泛地使用抗生素，細(xì)菌耐藥性和藥物殘留引起的社會(huì)問題也日益凸顯。為明確犢牛腹瀉病例中細(xì)菌性致病因素所占的比重及致病細(xì)菌的耐藥情況，特對(duì)接診的犢牛腹瀉病例進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。

2.3.1 樣品采集 應(yīng)用滅菌棉拭子采取病牛肛門處新鮮糞便或肛門拭子共計(jì)50份，標(biāo)記后冰浴中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室待檢。送檢的樣品短時(shí)間保存于4℃冰箱中，并在12h內(nèi)開展細(xì)菌分離工作。

2.3.2 細(xì)菌分離及純培養(yǎng) 將無菌采集的棉拭子樣品置于0.5ml滅菌生理鹽水中，混勻后，分別取0.1ml接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板及SS平板中，用滅菌L棒涂布均勻。將涂布后的平板倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色及鏡檢。大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板中的菌落形態(tài)為紫黑色并帶有綠色金屬光澤的菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的棒狀桿菌（圖7）；將疑似大腸桿菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進(jìn)行純培養(yǎng)。沙門氏菌在SS平板中的菌落形態(tài)為中心黑色的圓形菌落；挑取疑似菌落革蘭氏染色后，鏡檢可見革蘭氏陰性的小桿菌；將疑似沙門氏菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床中進(jìn)行純培養(yǎng)。

圖7 大腸桿菌鏡下為革蘭氏陰性短桿菌

2.3.3 細(xì)菌生化鑒定 將分離自選擇性培養(yǎng)基上的、經(jīng)染色鏡檢為疑似大腸桿菌及沙門氏菌的菌落增菌培養(yǎng)后調(diào)整濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝坏木?。根?jù)E40/12腸桿菌科細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定系統(tǒng)說明對(duì)疑似大腸桿菌進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，先進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性菌株繼續(xù)進(jìn)行16種生化反應(yīng)試驗(yàn)。與大腸桿菌生化特性100%符合的菌株判為大腸桿菌。對(duì)疑似沙門氏菌進(jìn)行鑒定時(shí)，先進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)，陽性菌株繼續(xù)進(jìn)行E40/12腸桿菌科細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定系統(tǒng)規(guī)定的16種生化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與沙門氏菌符合率為100%的確定為沙門氏菌。經(jīng)過細(xì)菌分離、染色及生化鑒定，最終從50份腹瀉糞便樣品中分離得到39株大腸桿菌和17株沙門氏菌（表4）。

表4 犢牛腹瀉糞便樣品中細(xì)菌分離情況

2.3.4 藥敏試驗(yàn) 經(jīng)分離培養(yǎng)及鑒定，將分離到的56株致病菌進(jìn)行常用藥物的藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 藥物對(duì)兩種病原菌的平均抑菌圈直徑 （mm）

由于抗生素在人醫(yī)及獸醫(yī)臨床的大量應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問題較為普遍，特別是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌及沙門氏菌的耐藥性急劇增強(qiáng)，尤其嚴(yán)重的是多重耐藥菌株的大量出現(xiàn)，會(huì)經(jīng)由食物鏈傳遞給人類而危及人類健康。

3 結(jié)論

從表1、表3及表5可知，牛病常見致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為普遍，僅有少數(shù)幾種藥物如頭孢類及喹諾酮類藥物能夠發(fā)揮有效抗菌作用，提示在生產(chǎn)中要選對(duì)藥、用對(duì)藥，在維護(hù)畜禽健康的同時(shí)保障人類健康。

參考文獻(xiàn)

［1］胡長敏，程淑芳，彭清潔等.肉牛主要細(xì)菌性疾病的診治及療效評(píng)價(jià)［J］.養(yǎng)殖與飼料，2013，8:9-11.

［2］石慧，鄭明學(xué)，王仲兵等.近年來牛主要細(xì)菌性傳染病及其流行特點(diǎn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，1:116-120.

［3］岳瑞超，程子龍，薛仲行等.對(duì)一例疑似肉牛運(yùn)輸熱的診斷［J］.中國動(dòng)物檢疫，2014，11:60-62+68.

［4］俸忠蘭，石鳳海，陶永艷等.一起牛巴氏桿菌病的細(xì)菌分離及藥敏試驗(yàn)［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2015，2:59-61.

［5］唐先春.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［6］鄧海平，俞詩源，王玲等.內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，2:595-596+598.

［7］張中文，吳國娟，劉鳳華等.北京地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，4:42-47.

［8］張忠厚.呼市地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［9］郭海勇，韓國華，崔京春.大連地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，9:163-166.

［10］荔霞，王勝義，劉永明等.犢牛腹瀉病因及其藥物防治研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，10:161-165.

［11］曹斌斌，趙勐，林濤等.犢牛腹瀉病因及治療方法［J］.中國奶牛，2012，5:51-53.

［12］王靜，何生虎，葛松等.犢牛腹瀉的發(fā)病原因及治療的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2013，3:59-62

中圖分類號(hào)：S858.23

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2016）04-0001-04

基金項(xiàng)目：山東省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（SDAIT-12-011-04）

*通訊作者

收稿日期：（2016–01–21）