張同禎李永生李 玥姚海梅趙 娟王 嬋趙 陽(yáng)王漢寧方永豐， *胡 晉

1甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 甘肅蘭州730070；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所， 甘肅蘭州730070；3浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院， 浙江杭州310058

?

多胺氧化酶（PAO）調(diào)控光誘導(dǎo)玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制

張同禎1，**李永生1，**李 玥2姚海梅1趙 娟1王 嬋1趙 陽(yáng)1王漢寧1方永豐1， *胡 晉3，*

1甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 甘肅蘭州730070；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所， 甘肅蘭州730070；3浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院， 浙江杭州310058

摘 要：以長(zhǎng)中胚軸玉米自交系PH4CV為材料， 在黑暗和光照兩種處理?xiàng)l件下研究了玉米中胚軸長(zhǎng)度與多胺氧化酶（polyamine oxidase， PAO）活性、H2O2含量、過氧化物酶（peroxidase， POD）活性及木質(zhì)素含量的關(guān)系。通過添加5 mmol L-1PAO 抑制劑 2-羥乙基肼（2-hydroxyethylhydrazine， 2-HEH）和 5 mmol L-1H2O2清除劑 N，N'-二甲基硫脲（N，N'-Dimethylthiourea， DMTU）及組織化學(xué)染色， 研究了影響中胚軸伸長(zhǎng)的H2O2來源及其積累部位。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法， 探究了光對(duì)ZmPAO基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明， 光照處理顯著抑制了玉米中胚軸的伸長(zhǎng)，同時(shí)顯著增加該部位的PAO活性、H2O2含量、POD活性及木質(zhì)素含量。相關(guān)性分析表明， 玉米中胚軸長(zhǎng)度與PAO活性、H2O2含量和木質(zhì)素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)， 與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)； PAO活性與H2O2含量、POD活性和木質(zhì)素含量均呈正相關(guān)。外源 PAO抑制劑和 H2O2清除劑處理試驗(yàn)， 玉米中胚軸表皮縱切面細(xì)胞長(zhǎng)度顯微觀察及中胚軸H2O2組織化學(xué)染色表明， PAO氧化分解多胺（polyamines， PAs）產(chǎn)生的H2O2參與了中胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)的生理調(diào)控， 從而抑制了中胚軸的伸長(zhǎng)。表達(dá)分析表明， ZmPAO基因在黑暗環(huán)境下的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定， 光刺激0.5 h后表達(dá)量迅速升高， 3 h后達(dá)到最大值， 隨后逐漸下降， 10 h后趨于穩(wěn)定。本研究表明， PAO在接受光刺激后活性升高， 氧化分解PAs產(chǎn)生H2O2， 從而誘導(dǎo)POD氧化胞壁的單木質(zhì)醇并聚合為木質(zhì)素， 使細(xì)胞壁硬化， 造成細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討PAO活性調(diào)控光誘導(dǎo)玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制和闡明玉米中胚軸對(duì)光逆境的響應(yīng)機(jī)理提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：玉米； 光照； 中胚軸伸長(zhǎng)； 多胺氧化酶； 表達(dá)分析

本研究由國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）前期研究專項(xiàng)（2012CB722902）， 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371708， 31201279）和甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（GSCS-2012-10）資助。

This study was supported by National Basic Research Program of China （973 Program， 2012CB722902）， the National Natural Science Foundation of China （31371708， 31201279）， and Research Program Sponsored by Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science （GSCS201210）.

第一作者聯(lián)系方式∶ 張同禎， E-mail∶ 294301204@qq.com**同等貢獻(xiàn)（Contributed equally to this work）

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1604.002.html

玉米（Zea mays L.）種子出苗率與土壤水分、溫度及播種深度密切相關(guān)。Dungan［1］和Hoshikawa［2］認(rèn)為玉米主要通過延伸中胚軸長(zhǎng)度達(dá)到深播出苗的目的，張磊等［3］認(rèn)為中胚軸和胚芽鞘協(xié)同決定幼苗的出土深度， 其中中胚軸起主導(dǎo)作用， 趙光武等［4］報(bào)道了深播出苗率與中胚軸長(zhǎng)度具有顯著的相關(guān)性且不同品種的耐深播能力差異明顯， 杜金友等［5］研究表明，玉米中胚軸的伸長(zhǎng)受到光照與激素等的影響。

Stuart等［6］和 Cosgrove［7］研究表明， 中胚軸伸長(zhǎng)的實(shí)質(zhì)是中胚軸細(xì)胞的延伸生長(zhǎng)和分裂， 其中細(xì)胞延伸生長(zhǎng)起著決定作用。李莉等［8］也認(rèn)為細(xì)胞長(zhǎng)度增加對(duì)中胚軸的伸長(zhǎng)貢獻(xiàn)更大， 細(xì)胞數(shù)目對(duì)中胚軸伸長(zhǎng)的促進(jìn)作用僅發(fā)生在伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的初期， 而細(xì)胞伸長(zhǎng)對(duì)中胚軸的促進(jìn)作用貫穿于中胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的整個(gè)時(shí)期。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞伸長(zhǎng)受膨壓的驅(qū)動(dòng)， 但木質(zhì)素作為細(xì)胞次生壁的重要組成部分， 決定了細(xì)胞壁彈性的大小， 木質(zhì)素含量升高會(huì)造成細(xì)胞壁松弛度下降， 抑制細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)［9］， 有研究認(rèn)為這一過程可以被某些酶或化學(xué)因素所介導(dǎo)［10］。在細(xì)胞壁木質(zhì)化過程中， H2O2的積累誘使過氧化物酶（POD）氧化細(xì)胞壁的單木質(zhì)醇為自由基并聚合為木質(zhì)素，導(dǎo)致細(xì)胞壁硬化從而阻礙了細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)［11］。在此過程中， H2O2可能的來源主要包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶［12］、POD［13］及多胺氧化酶（PAO）［14］三種途徑。

Yoda等［14］研究發(fā)現(xiàn)， 質(zhì)外體 H2O2主要是通過PAO氧化降解多胺（polyamines， PAs）途徑產(chǎn)生的。PAO 主要分布在禾谷類單子葉植物中［15-16］， 玉米中的PAO最早是在細(xì)胞質(zhì)外體被發(fā)現(xiàn)， 現(xiàn)已被通過生物化學(xué)、細(xì)胞免疫等方法定位于玉米的木質(zhì)部、木薄壁細(xì)胞、內(nèi)皮層、表皮層的初生和次生壁［17］。同時(shí)， PAO的核苷酸序列與氨基酸序列已被測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)其 cDNA全長(zhǎng) 1737 bp， 具有一個(gè)開放閱讀框，編碼500個(gè)氨基酸殘基［18-19］。Cervelli等［20］從玉米中分離到 3種編碼 PAO的基因， 發(fā)現(xiàn)它們極其保守，有幾乎相同的核苷酸序列， 由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成， 且具有高度的組織特異性。Federico等［21］研究發(fā)現(xiàn)豌豆在萌發(fā)后其莖基部木質(zhì)化程度與PAO氧化降解PAs產(chǎn)生H2O2有關(guān)， Laurenzi等［22］發(fā)現(xiàn)玉米中胚軸切段中H2O2的產(chǎn)生可被PAO抑制劑2-羥乙基肼（2-hydroxyethylhydrazine， 2-HEH）強(qiáng)烈抑制。Cona等［23］認(rèn)為光調(diào)控了玉米中胚軸表皮PAO活性，玉米中胚軸受到光刺激后， 其表皮的PAO活性及其mRNA水平均有所升高， 并且PAO活性的增加與光誘導(dǎo)的時(shí)間有緊密的聯(lián)系。

玉米中胚軸伸長(zhǎng)直接影響生產(chǎn)中種子出苗率及幼苗對(duì)干旱缺水環(huán)境的耐受能力， 國(guó)內(nèi)外關(guān)于玉米中胚軸的研究大多都集中于光對(duì)中胚軸伸長(zhǎng)的影響，對(duì)光調(diào)控中胚軸伸長(zhǎng)的作用機(jī)理研究較少。本研究以前期篩選的長(zhǎng)中胚軸玉米自交系 PH4CV為研究材料， 在黑暗和光照兩種條件下研究了玉米中胚軸長(zhǎng)度與PAO活性、H2O2含量、POD活性、木質(zhì)素含量之間的關(guān)系， 并通過實(shí)時(shí)定量熒光 PCR （qRTPCR）方法探究了玉米 ZmPAO基因的時(shí)空表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步探討PAO調(diào)控光誘導(dǎo)玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制及為闡明玉米中胚軸對(duì)光逆境的響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

前期已篩選的長(zhǎng)中胚軸玉米自交系PH4CV， 由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院玉米遺傳育種課題組提供?？俁NA提取試劑盒RNA simple Total RNA Kit購(gòu)自天根生化科技北京有限公司； 第一鏈 cDNA合成試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司； 其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 材料培養(yǎng)

挑選整齊飽滿的干凈種子， 以 75%酒精溶液和0.1%氯化汞水溶液消毒后用無菌水沖洗 3次， 室溫浸種6 h后于25℃條件下培養(yǎng)24 h。將萌動(dòng)一致的種子轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上， 置25℃人工智能培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）中進(jìn)行光暗處理（表 1）。第1組為對(duì)照組， 第 2組為 5 mmol L-12-羥乙基肼（2-HEH）處理組， 第3組為5 mmol L-1N，N'-二甲基硫脲（DMTU）處理組； 設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。在處理0、0.5、1、3、6、10、24、48及72 h后進(jìn)行各試驗(yàn)組形態(tài)及生理指標(biāo)測(cè)定， 同時(shí)提取樣品總RNA用于半定量及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

表1 材料培養(yǎng)方法Table 1 Material culture methods

1.3 中胚軸形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)的測(cè)定及組織顯微觀察

用毫米尺測(cè)量中胚軸長(zhǎng)度， Sartorius BSA-224S電子分析天平測(cè)量中胚軸的干鮮重， 以測(cè)定平均值（n≥20）表示量值大小。參照汪天等［24］的方法測(cè)定多胺氧化酶活性； 參照Brennan等［25］的方法測(cè)定H2O2含量； 參照 Orozco-Cardenas等［26］的方法進(jìn)行 H2O2組織化學(xué)定位； 采用愈創(chuàng)木酚法［27］測(cè)定 POD活性；參照 Syros等［28］的方法測(cè)定木質(zhì)素含量； 參照Tanaka等［29］的方法以顯微觀察玉米中胚軸縱切面細(xì)胞長(zhǎng)度。

1.4 ZmPAO基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

按照RNA simple Total RNA Kit說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析， 提取玉米中胚軸總RNA， 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性， 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和質(zhì)量。根據(jù)GenBank中ZmPAO基因（NM_001111636）和β tubulin-2基因（NM_ 001111956）序列， 分別設(shè)計(jì)特異性引物， ZmPAO基因上游引物（ZmPAO-F）為5′-AGTGTGGCAGGAGTTC GAGAA-3′， 下游引物（ZmPAO-R）為5′-ATGATCTCC GCCTTGGTCTG-3′； β tubulin-2基因上游引物（β tubulin-2-F）為5′-TTCATGTGGTAGGTTCGTGCC-3′，下游引物（β tubulin-2-R）為5′-TGGCCGAAGACGAA GTTGTC-3′。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈， 以cDNA為模板， 按SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）說明書進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系含SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL、 PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye （50×） 0.4 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性31 s； 95℃變性5 s， 60℃退火34 s， 72℃延伸1 min， 40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定每個(gè)基因的響應(yīng)Ct值， 以β tubulin-2為內(nèi)參矯正 PCR模板的拷貝數(shù)， 采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量， 同時(shí)進(jìn)行半定量RT-PCR， 設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和最小顯著差異性檢驗(yàn)（Duncan's新復(fù)極差法）， 利用Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAO調(diào)控光誘導(dǎo)的玉米中胚軸伸長(zhǎng)

2.1.1 光對(duì)玉米中胚軸長(zhǎng)度及生物量積累的影響

光不僅是高等植物進(jìn)行光合作用的能量來源，也是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的信號(hào)物質(zhì)。由圖 1可以看出， 光照處理顯著抑制了玉米中胚軸的伸長(zhǎng)，在處理24、48和72 h后， 中胚軸長(zhǎng)度分別比對(duì)照減小了19.2%、60.6%和66.5%， 且在48 h后與對(duì)照的差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）； 同時(shí)， 光照也抑制了玉米中胚軸生物量的積累， 處理72 h后中胚軸鮮重（FW）和干重（DW）分別比對(duì)照減少了60.8%和45.5%，差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）， 說明光照處理抑制了玉米中胚軸的伸長(zhǎng)及生物量的積累。

圖1 光對(duì)玉米中胚軸長(zhǎng)度及生物量積累的影響Fig.1 Effects of light on length and biomass accumulation of mesocotyl in maize

圖2 光對(duì)玉米中胚軸PAO活性及長(zhǎng)度的影響Fig.2 Effects of light on PAO activity and mesocotyl elongation in maize

2.1.2 光對(duì)玉米中胚軸 PAO活性的影響 光照處理顯著提高了玉米中胚軸中PAO的活性， 在處理24、48和72 h后PAO活性分別升高了27.7%、38.9% 和 16.9%， 而中胚軸長(zhǎng)度累計(jì)縮短了 66.5% （圖 2）；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)施加5 mmol L-12-HEH對(duì)黑暗與光照環(huán)境下PAO活性均強(qiáng)烈抑制， 使光下中胚軸長(zhǎng)度累計(jì)增加了 155.9%， 但仍略小于黑暗環(huán)境中胚軸長(zhǎng)度。由此表明， 光照抑制玉米中胚軸伸長(zhǎng)可能與PAO活性的升高有關(guān)。L-HT處理72 h后， PAO活性相比同樣處理24 h及48 h略有升高， 認(rèn)為當(dāng)施加的2-HEH被消耗后， 光可以繼續(xù)激發(fā)PAO活性從而抑制中胚軸伸長(zhǎng)。

2.1.3 光對(duì)玉米中胚軸 H2O2含量的影響 PAO 在O2和H2O存在的情況下主要將PAs氧化降解為吡咯啉、1-（3-氨丙基）2-吡咯啉和二氨丙烷， 同時(shí)產(chǎn)生 H2O2［30］。為探究 H2O2是否與玉米中胚軸伸長(zhǎng)有關(guān)， 對(duì)不同處理下中胚軸H2O2含量和長(zhǎng)度進(jìn)行了測(cè)定分析（圖3）， 發(fā)現(xiàn)光照處理后， 中胚軸H2O2含量分別升高了 19.5%、39.2%和 53.9%， 中胚軸伸長(zhǎng)被不同程度的抑制， 累計(jì)縮短了66.5%； 施加5 mmol L-1DMTU時(shí)， 黑暗和光照環(huán)境下中胚軸H2O2含量均有所下降， 與對(duì)照差異極顯著（P ＜ 0.01）； L-DH處理72 h后， 中胚軸長(zhǎng)度相比L-CK增長(zhǎng)了2.4倍。說明H2O2含量的變化可能影響了中胚軸伸長(zhǎng)的生理過程。

生物體內(nèi) H2O2來源并不是唯一的， 質(zhì)膜 H2O2主要來源于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶［12］， 細(xì)胞壁 H2O2主要來源于POD［13］， 而質(zhì)外體H2O2主要來源于PAO［14］。分析施加5 mmol L-12-HEH和5 mmol L-1DMTU后， 中胚軸 H2O2水平及 PAO活性的變化（圖 4）， 可以發(fā)現(xiàn)，PAO活性被抑制后， H2O2含量極顯著下降（P ＜ 0.01），清除中胚軸 H2O2時(shí)， PAO活性差異并不顯著（P ＞0.01）。說明是質(zhì)外體 H2O2影響了玉米中胚軸伸長(zhǎng)，其來源于PAO氧化分解PAs。

2.1.4 光對(duì)玉米中胚軸 POD活性和木質(zhì)素含量的影響 有研究表明， 質(zhì)外體H2O2會(huì)促進(jìn)POD氧化細(xì)胞壁單木質(zhì)醇為自由基， 從而使其聚合成木質(zhì)素［31］。對(duì)黑暗與光照處理下， 中胚軸POD活性及木質(zhì)素含量測(cè)定（圖5）發(fā)現(xiàn)， 光照處理下玉米中胚軸中的POD活性和木質(zhì)素含量極顯著升高（P ＜ 0.01）； 光照處理72 h后， POD活性和木質(zhì)素含量分別累計(jì)增加了31.4%和32.9%， 說明POD活性和木質(zhì)素含量在PAO參與光抑制中胚軸伸長(zhǎng)的生理生化過程中發(fā)揮了作用。

圖3 光對(duì)玉米中胚軸H2O2含量和長(zhǎng)度的影響Fig.3 Effects of light on H2O2content and mesocotyl elongation in maize

圖4 5 mmol L-12-HEH及5 mmol L-1DMTU對(duì)中胚軸H2O2含量和PAO活性的影響Fig.4 Effect of 5 mmol L-12-HEH and 5 mmol L-1DMTU on H2O2content and PAO activity in maize

2.1.5 中胚軸長(zhǎng)度與 PAO活性、POD活性、H2O2含量及木質(zhì)素含量之間的相關(guān)性分析 由表2可以看出， 中胚軸長(zhǎng)度與PAO活性、H2O2含量和木質(zhì)素含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P ＜ 0.01）， 與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P ＜ 0.05）； PAO活性與H2O2含量及木質(zhì)素含量也存在極顯著正相關(guān)（P ＜ 0.01）， 與POD活性顯著正相關(guān)性（P ＜ 0.05）； POD活性與H2O2含量、木質(zhì)素含量達(dá)到顯著正相關(guān)（P ＜ 0.05）。由此表明，PAO、H2O2、POD和木質(zhì)素在玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理過程中存在著某種聯(lián)系。

2.1.6 玉米中胚軸表皮細(xì)胞伸長(zhǎng)和 H2O2組織化學(xué)定位 玉米中胚軸伸長(zhǎng)被抑制， 是否是其細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到阻礙所致， 對(duì)不同處理下玉米中胚軸縱切面顯微觀察（圖6-A-D）， 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)度存在明顯的差異。黑暗處理（圖6-A）的細(xì)胞長(zhǎng)度最大， 接近100 μm； 光照處理（圖6-B）的細(xì)胞長(zhǎng)度最小， 幾乎所有細(xì)胞長(zhǎng)度均小于50 μm； 光照情況下施加5 mmol L-12-HEH和5 mmol L-1DMTU后（圖6-C， D）， 細(xì)胞長(zhǎng)度均大于50 μm但小于100 μm。通過H2O2組織化學(xué)染色（圖 6-E-H）發(fā)現(xiàn)， 中胚軸表皮 H2O2的積累量為D-CK ＜ L-DT ＜ L-HT ＜ L-CK。證明H2O2的積累促進(jìn)了木質(zhì)素的合成， 使細(xì)胞壁硬化， 阻礙了細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

圖5 光對(duì)玉米中胚軸POD活性和木質(zhì)素含量的影響Fig.5 Effects of light on POD activity and lignin content in maize mesocotyl

表2 中胚軸長(zhǎng)度、PAO活性、H2O2含量、POD活性和木質(zhì)素含量之間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients among mesocotyl length， PAO activity， H2O2content， POD activity， and lignin content

圖6 玉米中胚軸表皮細(xì)胞伸長(zhǎng)和H2O2組織化學(xué)染色Fig.6 Microgram of epidermal cells of mesocotyl and histochemical H2O2localization in maize

2.2 ZmPAO基因的表達(dá)模式分析

為證明 PAO活性是受光照促進(jìn)的， 進(jìn)行了ZmPAO基因的表達(dá)模式分析， 將提取的玉米中胚軸總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)后反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 以設(shè)計(jì)的特異性引物 ZmPAO F/R 和 β tubulin-2 F/R 進(jìn)行qRT-PCR及半定量RT-PCR （圖7）?？梢钥闯觯?光照處理下ZmPAO基因的表達(dá)量顯著高于黑暗處理（P ＜ 0.05）。光刺激0.5 h后， 表達(dá)量上升了2.1倍， 3 h后達(dá)到最大， 是黑暗處理的2.5倍， 之后逐漸下降， 10 h后逐漸趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明ZmPAO基因的表達(dá)是受光信號(hào)調(diào)控的， 光刺激后， 其表達(dá)量會(huì)迅速升高，達(dá)到峰值后會(huì)隨即緩慢下降并趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.3 PAO 活性調(diào)控光誘導(dǎo)玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果， 我們推測(cè)PAO活性調(diào)控光誘導(dǎo)玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制可能為， PAO在接受光刺激后活性升高， 氧化分解 PAs產(chǎn)生H2O2， 從而促進(jìn)POD氧化單木質(zhì)醇為自由基進(jìn)而聚合為木質(zhì)素， 使細(xì)胞壁硬化， 細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻， 最終導(dǎo)致中胚軸伸長(zhǎng)生長(zhǎng)被抑制（圖8）。

圖7 ZmPAO基因的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression pattern of ZmPAO

圖8 PAO參與光誘導(dǎo)的中胚軸伸長(zhǎng)可能的生理機(jī)制Fig.8 Possible physiological mechanism of regulating

3 討論

光是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中重要的信號(hào)分子與能量物質(zhì)， 在植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育等方面起重要作用［32］， 不適時(shí)的光刺激會(huì)造成植物生長(zhǎng)逆境， 改變植物光合作用、同化物質(zhì)運(yùn)輸和形態(tài)建成等生理生化過程， 影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育［33］。本研究發(fā)現(xiàn)， 對(duì)萌發(fā)后的玉米種子進(jìn)行光照處理， 中胚軸長(zhǎng)度、鮮重和干重的積累均被顯著抑制， 中胚軸PAO活性、H2O2含量、POD活性和木質(zhì)素含量有不同程度的升高， 這與蘇國(guó)興［34］研究大豆下胚軸伸長(zhǎng)的結(jié)果基本一致。PAO活性被抑制后，H2O2含量隨之降低， 從而解除了光對(duì)中胚軸伸長(zhǎng)的抑制作用； 而清除H2O2處理后， PAO活性并無明顯變化， 但顯著緩解了光對(duì)中胚軸伸長(zhǎng)的抑制作用，由此表明， PAO通過氧化分解PAs產(chǎn)生H2O2調(diào)控了中胚軸的伸長(zhǎng)。2-HEH和DMTU處理后， H2O2不能被完全清除， 說明還有其他代謝途徑產(chǎn)生了 H2O2，這與Hohl等［35］的研究結(jié)果相一致。

玉米中胚軸縱切面細(xì)胞顯微觀察和 H2O2組織化學(xué)染色表明， H2O2調(diào)控的細(xì)胞壁硬化、細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻在這一調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮了作用， 這與Zhao等［36］報(bào)道的中胚軸伸長(zhǎng)與細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有關(guān)是一致的，但他認(rèn)為， 細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的調(diào)控主要是由中胚軸內(nèi)源赤霉素（gibberellin， GA3）含量變化引起的， 這與本研究結(jié)果中細(xì)胞伸長(zhǎng)受阻可能是由于細(xì)胞木質(zhì)化程度升高所引起的不完全一致。ZmPAO基因qRT-PCR分析表明， 玉米中胚軸表皮細(xì)胞ZmPAO基因的表達(dá)受光信號(hào)調(diào)控， 光刺激后， 其表達(dá)量出現(xiàn)迅速升高而后平緩下降到趨于穩(wěn)定的狀態(tài)， 且光處理下其活性均高于黑暗處理， 這與 Laurenzi等［22］的研究結(jié)果和ZmPAO基因表達(dá)是由依賴光敏素的轉(zhuǎn)錄激發(fā)子在光響應(yīng)元件上的作用所介導(dǎo)的［23］研究結(jié)果相類似。

玉米幼苗出土后， 芽鞘首先感知到光信號(hào)， 調(diào)控中胚軸的伸長(zhǎng)， 可能存在從芽鞘到中胚軸的某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。杜金友等［5］認(rèn)為光和內(nèi)源激素影響了玉米中胚軸的伸長(zhǎng)， Cona等［23］研究表明， 玉米中胚軸中PAO活性在受光調(diào)控的同時(shí)， 還受到吲哚乙酸（indoleacetic acid， IAA）和萘乙酸（naphthylacetic acid， NAA）的調(diào)控， 其基因表達(dá)受光和激素共同調(diào)控。本研究表明玉米中胚軸伸長(zhǎng)與光誘導(dǎo)的 PAO活性有關(guān)， 當(dāng)芽鞘接受到光刺激后， 芽鞘合成的IAA向下垂直運(yùn)輸， 提高了中胚軸中PAO的活性， 氧化分解PAs產(chǎn)生的H2O2在薄壁質(zhì)外體上驅(qū)動(dòng)了POD催化的薄壁單木質(zhì)醇多聚體酚類殘基的氧化交聯(lián)和木質(zhì)化的形成［31，37］， 從而完成細(xì)胞壁的硬化， 抑制了細(xì)胞的伸長(zhǎng)［35，38］。有研究發(fā)現(xiàn)， PAO蛋白通過非共價(jià)的方式結(jié)合了黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide， FAD）［19，39］， 這表明PAO有可能是直接接受光刺激而非通過其他物質(zhì)運(yùn)輸或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式完成了其活性升高的生理生化過程。玉米中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制是光暗影響的多個(gè)生理生化過程共同影響的形態(tài)建成過程， 是否還存在其他調(diào)控 PAO活性參與中胚軸伸長(zhǎng)的生理機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

明確了光誘導(dǎo)的PAO活性升高是導(dǎo)致玉米中胚軸伸長(zhǎng)受到抑制的主要原因， ZmPAO基因的表達(dá)受光的誘導(dǎo)。PAO調(diào)控光誘導(dǎo)玉米中胚軸伸長(zhǎng)可能的生理機(jī)制為光促進(jìn)PAO活性增強(qiáng)， 氧化分解PAs造成H2O2積累， 從而誘使POD氧化細(xì)胞壁單木質(zhì)醇為自由基， 進(jìn)一步聚合為木質(zhì)素使細(xì)胞壁硬化， 細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討該生理機(jī)制和闡明玉米中胚軸對(duì)光逆境的響應(yīng)機(jī)理提供了理論依據(jù)。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00734

*通訊作者（

Corresponding authors）∶ 方永豐， E-mail∶ fangyf@gsau.edu.cn； 胡晉， E-mail∶ jhu@zju.edu.cn

收稿日期Received（）∶ 2015-09-16； Accepted（接受日期）∶ 2016-03-02； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-03-11.

Physiological Mechanism Regulating Light-induced Mesocotyl Elongation by Polyamine Oxidase （PAO） in Maize

ZHANG Tong-Zhen1，**， LI Yong-Sheng1，**， LI Yue2， YAO Hai-Mei1， ZHAO Juan1， WANG Chan1， ZHAO Yang1， WANG Han-Ning1， FANG Yong-Feng1，*， and HU Jin3，*

1Gansu Key Laboratory of Crop Improvement and Germplasm Enhancement/Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science/Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2Institute of Crop Science， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China；3College of Agriculture & Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China

Abstract：In this study， maize inbred line PH4CV was cultured under in MS medium under both dark and light conditions to investigate the relationship of length of mesocotyl with activity of polyamine oxidase （PAO）， activity of peroxidase （POD）， contents of H2O2and lignin.In addition， after treated with 5 mmol L-12-hydroxyethylhydrazine （2-HEH） and 5 mmol L-1N，N'-Dimethylthiourea （DMTU）， the origin and accumulation site of H2O2in mesocotyl elongation were assessed by using histochemical staining method and the effect of light on expression of ZmPAO gene was evaluated.The results indicated that the elon-gation of mesocotyl was significantly inhibited while the contents of H2O2and lignin and the activities of POD and PAO were enhanced by light.Correlation analysis showed that the length of mesocotyl was negatively correlated with the PAO activity， H2O2content， POD activity， and lignin content， and the PAO activity was positively correlated with the H2O2content， the POD activity，and the lignin content.The assay with 2-HEH and DMTU， the microgram of epidermal cells， and histochemical localization of H2O2revealed that H2O2participated in mesocotyl elongation， in which PAO catalyzed polyamines （PAs） degradation to produce H2O2resulting in the inhibition of mesocotyl elongation.Results of qRT-PCR revealed that the expression level of ZmPAO was relatively stable in dark and rose rapidly of 0.5 hour after exposing to light， with a maximum value after three hours of light treatment， then declined gradually， and finally showed a steady level after ten hours.This study suggests that the activity of PAO can be promoted by light treatment， and initiate the PAs-mediated induction of H2O2， resulting in the oxidation of lignin monomers on cell wall by POD.The produced free radicals are then transformed into lignin in a polyforming process which marked the cell wall hardened and cell elongation inhibited.This study may provide a theoretical basis for understanding the physiological mechanism underlying the PAO-mediated mesocotyl elongation and gain insights into the response of maize mesocotyl to the light stress.

Keywords：Maize； Light； Mesocotyl elongation； Polyamine oxidase； Expression analysis